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细胞自噬是细胞在营养能量缺乏时,产生的一种自我保护和应激机制。广义上的自噬是指胞浆内聚集的蛋白质或一些受损细胞器被包裹在自噬小泡(autophagosome)中,与溶酶体融合并被降解的过程。这个过程不仅产生氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等小分子营养物质以补偿外部营养供应缺失,还能够有效的清除衰老及损伤的细胞器,如线粒体、过氧化物酶体、内质网与核糖体等,以维持细胞内稳态和实现细胞器的更新。线粒体是真核生物细胞中能量转换的“动力工厂”,伴随着氧化磷酸化的发生,不可避免地会产生大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),超负荷的ROS会引起线粒体周围环境的失衡,导致线粒体损伤,最终引发细胞凋亡。因此清除损伤的线粒体,对于维持细胞内环境的稳定是至关重要的。细胞这种自主选择性吞食线粒体的现象被称为线粒体自噬(mitophagy)。线粒体自噬的失调,常与神经退行性疾病、心血管疾病、神经肌肉疾病以及肿瘤等疾病密切相关。近期研究表明,帕金森疾病(Parkinson’s disease,PD)模型小鼠的细胞中,线粒体表现出膨大和水肿的异常形态,提示PD的发病与线粒体清除机制紊乱相关。Parkin与PINK1(PTEN induced kinase gene)是两个鉴定出与常染色体隐性家族性青少年帕金森疾病(Autosomal Recessive Juvenile Parkinson disease,AR JP)有关的突变基因。有研究发现Parkin会在线粒体去极化导致的线粒体自噬时,转位至受损线粒体上,而这个过程依赖于PINK1的招募。Parkin是一个RBR蛋白家族的泛素化连接酶,它可以在线粒体解偶联剂CCCP(Carbonyl cyanide 3 chlorophenylhydrazone)刺激线粒体损伤的条件下,通过识别一些特定的线粒体外膜上的底物蛋白,将其进行泛素化标记以促进底物蛋白与受损线粒体的降解。PINK1/Parkin途径的线粒体自噬,存在着一定局限性。比如在多种细胞、组织和肿瘤中Parkin表达降低或不表达,因此,寻找介导肿瘤细胞线粒体自噬关键分子一直是领域内的热点问题。在本研究中,我们建立了CCCP刺激诱导线粒体自噬的模型以及评价体系,并对RBR家族蛋白进行深度调研,筛选出一个与Parkin结构非常相似的泛素化连接酶HOIL 1L(heme oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1 like)参与线粒体自噬的调节。主要研究结果如下:1.建立线粒体自噬的模型及其检测体系1)通过使用特异性抗体对多种肿瘤细胞系裂解液中Parkin及HOIL 1L蛋白表达水平进行检测,发现Parkin在不同肿瘤细胞系中表达不尽相同,而HOIL 1L表达较为广泛。因此,选取了没有Parkin表达的He La细胞进行模型建立。2)利用线粒体呼吸链解偶联剂CCCP和寡霉素Oligomycin联合处理He La细胞,通过破坏线粒体膜电势诱导细胞线粒体损伤的发生。利用免疫荧光的手段,在CCCP刺激24 h时,观测到线粒体外膜蛋白TOM20所指示的线粒体由正常的丝网状结构分裂为片段化。3)在诱导细胞线粒体损伤模型中,通过外源过表达已知调控分子Parkin,验证了在CCCP刺激24 h时,可以造成线粒体的清除。4)完善自噬检测体系,在CCCP刺激条件下,验证自噬标志物LC3会在线粒体定位及累积。2.泛素连接酶HOIL 1L介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生1)通过已建立的线粒体自噬模型,过表达RBR家族蛋白HOIL 1L可以一定程度上介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生。2)通过已建立的线粒体自噬模型,过表达RBR家族蛋白HOIP无法介导Parkin非依赖线粒体自噬的发生。3)建立稳定过表达mito Keima细胞的线粒体自噬模型。4)在稳定过表达mito Keima细胞中对上述现象进行验证,证明在过表达HOIL 1L时,线粒体自噬指数上升。5)此外,利用Annexin V FITC/PI凋亡试剂盒排除了诱导细胞线粒体自噬模型早期会产生细胞凋亡的影响。3.泛素连接酶HOIL 1L促进Parkin依赖线粒体自噬的发生1)通过敲低HOIL 1L发现,在过表达Parkin的细胞中,刺激依赖的线粒体降解被抑制,而表现出Parkin突变体产生的表型。2)在过表达Parkin且同时分别过表达HOIL 1L、HOIP以及二者的组合进行相互作用实验,结果显示,Parkin与HOIL 1L存在相互作用。当HOIL 1L与HOIP共表达时,相互作用增强。提示我们,HOIL 1L可能通过帮助Parkin解除自抑制来参与线粒体自噬调控。综上,我们的研究主要发现了一个RBR家族的泛素化连接酶HOIL 1L可以介导Parkin非依赖途径细胞线粒体自噬的发生。而在Parkin依赖线粒体自噬中,HOIL 1L可与Parkin相互作用,从而促进Parkin依赖线粒体自噬的发生。