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研究目的:构建表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HpCagA的重组腺病毒对哮喘TH1/TH2细胞因子的调控作用,获得防治哮喘的新方法奠定基础.研究方法:(一)重组腺病毒的包装(1)CagA的扩增和克隆:首先自行设计一对含有BglⅡ和XhoⅠ酶切位点的特异性HP-CagA基因上下游引物,采用Ω公司细菌DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌NCTC11637细菌基因组DNA,以细菌Helicobacter pylori基因组DNA为模板,通过PCR获得CagA基因序列.由于高保真pfuTaq酶不具备在核苷酸尾部自行加A的功能,所以PCR后用BioDevDNA片断玻璃奶回收试剂盒回收目的片断后进行加A反应,然后T-A克隆,经选择性培养基(含氨苄抗性)和蓝白斑筛选,挑取白斑阳性克隆,获得T-HPCagA重组质粒,经酶切鉴定正反向后将正向重组pGEMT-CagA送上海生工公司及博亚公司进行测序,和Genebank中的cagA序列比对序列正确.(2)质粒pAdTrackCMV/CagA的构建:用BglⅡ和XhoⅠ双酶切T-HPCagA,同时双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,用DNA快速回收试剂盒纯化PCR产物,分别回收CagA片断和pAdTrack-CMV片断后,进行连接反应,将CagA定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ和XhoⅠ位点之间,连接产物转化E.coli DH10B涂LB平皿(kan,50 μ g/ml),碱裂解法小量制备质粒,经酶切鉴定后,含有CagA基因的穿梭质粒命名为获得重组质粒pAdTrackCMV/CagA.(3)同源重组质粒pAdeasy-TrackCMV/CagA的构建:由于一般的化学转化法的转化效率难于满足同源重组的条件,因此我们采用了电穿孔法进行转化.首先制备用于电转化的E.coliBJ5183细胞,其转化效率一般在10<9>克隆数/μ gDNA.用PmeⅠ单切pAdTrackCMV/CagA,玻璃奶回收目的片段和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共电传E.coliBJ5183细胞中,37℃培养1h后将菌液涂于LB平板上(含Kan,50 μ g/ml),37℃过夜培养.将初步获得的重组质粒Ca转E.coliDH10中,获得高拷贝的该重组质粒.经酶切鉴定后将此重组质粒命名为pAdeasy-TrackCMV/CagA.(4)重组腺病毒Adeasy-CagA的包装:T-25培养瓶中培养293细胞,使其丰度在50％~70％.将经酶切鉴定的重组质粒pAdeasy-TrackCMV/CagA用PacⅠ消化,充分去处ori和kan抗性基因等质粒构件,并暴露出反向末端重复序列(ITR),酶切产物经酚-氯仿抽提,乙醇沉淀后,脂质体转染293细胞,转染时使用无血清,无PS,含有Glutamine的DMEM培养基,次日移弃含有Lipofectamine-DNA混合物的培养基,补加小牛血清的DMEM培养液,常规培养细胞,约7~14天后,盲传一两代,同时观察CPE,待细胞完全病变后,荧光显微镜观察GFP表达,出现绿色荧光后,收集病变细胞,连同上清冻存于-20°C,5初步认为得到目的基因的重组腺病毒.通过该技术成功构建了非复制型重组腺病毒AdEasyHPCagA.(二)获得重组病毒后对其生物学特征进行了全面研究:透射电境下重组病毒具有典型的腺病毒形态,直径约70nm;PCR结果表明重组腺病毒基因组中整合有CagA基因,经过连续传代后外源基因在重组腺病毒基因组中可稳定存在;RT-PCR检测到重组腺病毒感染细胞可转录出外源基因特异性的mRNA;Western blot结果表明外源基因在重组腺病毒感染的细胞中可有效的表达.结论:经过各个步骤的鉴定,该文成功构建了表达幽门螺杆菌CagA基因的非复制型重组腺病毒,从而为探讨表达HpCagA的重组腺病毒对哮喘TH1/TH2细胞因子的调控作用以及为获得防治哮喘的新方法奠定了基础.