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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性菌,属于蜡样芽胞杆菌族,在产生芽胞的同时会产生伴胞晶体。伴胞晶体主要由cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白组成。Bt是世界上应用最广泛的微生物杀虫剂,其晶体和芽胞可以作为制剂在田间应用,多种环境因子(如阳光辐射、雨水、温度)会影响晶体稳定性,其中阳光中的紫外线(Ultraviolet,简称UV)辐射可以使晶体失去杀虫活性。研究表明晶体包裹在母细胞中可有效降低其对UV的敏感度。本研究拟研究母细胞裂解关键水解酶,探索新的Bt菌株遗传改良策略。前期研究发现苏云金芽胞杆菌cwlB基因缺失能延迟母细胞的裂解,但并不能阻断母细胞的裂解。本研究鉴定了一个新的参与Bt母细胞裂解的基因cwlC,并对其生化特性进行研究。cwlC基因编码的蛋白,CwlC,包括一个N-末端的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(MurNAc-LAA)结构域和一个C-末端的amidase02-C结构域,预测amidase02-C是细胞壁结合结构域。NCBI blastP结果表明,与CwlC序列相似性在90%以上的芽胞杆菌菌株多达100多种,其中多属于蜡样芽胞杆菌族,如蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus,简称Bc)。反转录PCR和cDNA 5?末端快速扩增PCR(5?RACE)实验表明cwlC是一个单顺反子,转录起始位点位于起始密码子上游第21个核苷酸“G”处。cwlC启动子转录活性测定实验表明其受σ~k控制和GerE正调控。构建了cwlC基因的缺失突变株和恢复突变株,结果发现cwlC基因缺失可完全阻断母细胞裂解,并且不影响芽胞形成和Cry1Ac蛋白的产量。在大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)中表达的带组氨酸标签的CwlC-His蛋白分子量大小预测为27.9 kDa,细胞壁水解活性实验表明CwlC可水解体外制备的细胞壁;Western blot实验表明CwlC可与Bt HD73细胞壁结合。CwlC水解活细胞实验表明CwlC可水解并杀死对数生长期的Bt和Bc细胞。SignalP 4.1 Server软件分析表明CwlC蛋白不含有信号肽。激光共聚焦显微镜(CLSM)观察突变株HD(ΔcwlC)和野生株HD73细胞形态表明,Bt细胞膜先破裂,细胞壁再裂解。CLSM观察GFP-CwlC融合蛋白在Bt HD73中的定位发现,CwlC蛋白在芽胞晚期细胞的细胞质中表达,在芽胞中不表达,在细胞膜破裂的细胞中发现有GFP-CwlC蛋白存在于细胞外被。因此,推测CwlC水解酶是待细胞膜破裂后进入细胞外被进行细胞壁水解。鉴定了参与母细胞裂解的关键水解酶基因cwlC,并探究了CwlC水解酶的转录调控情况和生物功能,为高效广谱和功能稳定的Bt工程菌的构建奠定良好的分子基础;另外,为生物医药和食品生产病原菌防治开辟新的思路。