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研究背景与目的：特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是最常见的肺间质疾病,也是呼吸系统最严重疾病之一,病程一般呈进行性发展,最终可以引起呼吸衰竭而死亡,其5年生存率不超50%,因此受到许多国内外学者的关注。IPF发病机制不明,治疗效果差。研究其发病机制,拓展新的治疗措施具有重要意义。近年来血管生成在肺纤维化发生中的作用日益受到重视,血管生成可能是肺纤维化形成过程中的一个关键环节。很多研究发现在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中,抑制促血管生成因子或给予抗血管生成因子干预减轻血管生成能改善肺纤维化的进展。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前已知的最主要的血管生成因子,能够促进新血管的生成,增加血管通透性,并参与炎细胞浸润、维持其存活和促进转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)表达等,VEGF受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2)是VEGF发挥功能的主要受体。VEGF在肺纤维化形成中过度表达。抑制VEGF/VEGFR2通路可能通过抑制异常血管生成改善肺纤维化。VEGF能激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)。ERK1/2是目前发现的一个重要的细胞增殖信号调节蛋白,能调控血管内皮形态及多种炎性介质和细胞因子的表达。ERKl/2激活后可以转移到细胞核内,磷酸化一系列转录因子包括核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB),进而调控下游蛋白转录表达。NF-κB在炎症反应调控中起核心作用,参与调控许多细胞因子表达,包括促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)和促纤维化因子TGFβ1.内皮抑素能抑制VEGF/VEGFR2通路,在其他疾病研究中对于抑制ERK1/2和NF-κB活化、下调TNT-α和TGF β1表达的作用也有报道。基于以上通路及细胞因子在肺纤维化过程中的重要作用,推测应用内皮抑素干预血管形成及炎症反应可能改善肺纤维化进展。本研究将建立博来霉素(bleomycin, BLM)诱导的大鼠肺纤维化模型,给予重组人血管内皮抑素(recombinant human endostatin, rhES)皮下注射,观察血管形成、炎症及纤维化改变,探讨内皮抑素对肺纤维化的可能的作用机制。方法：1.肺纤维化模型建立：将博来霉素经气管注入SD大鼠,观察动物一般情况及不同时期肺组织切片HE染色及Masson染色,确定成功制备肺损伤纤维化模型。2.对血管形成、炎症及肺纤维化的影响：实验动物分为正常对照组(生理盐水,SA group),博来霉素模型组(BLM group),早期rhES组(BLM+前14天rhES, E-ES group)、晚期rhES组(BLM+后14天rhES, L-ES group)及全程rhES组(BLM+28天rhES, W-ES group)。每组15只大鼠,分别于7天、14天、28天各处死5只。应用HE染色、Masson染色及羟脯氨酸测定研究肺纤维化大鼠模型肺损伤不同阶段肺部炎症及纤维化改变；测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白细胞计数及Wright-Giemsa染色观察白细胞分类改变,并测定BALF蛋白与血清总蛋白浓度,计算血管通透指数(protein permeability index, PPI);免疫组织化学方法测量微血管密度(microvascular density, MVD)。3.机制研究：免疫组织化学方法测定VEGFR2蛋白表达；酶联免疫吸附(enzyme-linked immune sorbent assay, ELISA)分别测量肺组织匀浆VEGF、 TGF-β1及BALF中TNF-α表达。实时荧光定量PCR分析VEGF、VEGFR2mRNA水平表达；Western blot法分析ERK1/2及NF-κB的激活。4.结果统计：应用软件SPSS18.0进行数据统计,所有计量数据都用均数±标准差来表示,采用双因素方差分析进行统计学分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果：1.动物模型建立：正常大鼠镜下见肺结构清晰正常,各观察时期无结构改变,无炎细胞浸润及胶原纤维沉积。给予博来霉素气管内灌注后,第7天见肺泡间隔增宽,病灶区域内巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润明显,少量胶原纤维沉积；14天肺泡间隔明显增宽,仍有大量炎性细胞浸润但较前减轻,成纤维细胞及胶原纤维增多；第28天可见肺泡结构破坏紊乱,肺间质纤维成分大量沉积,炎症细胞较前减少。2.动物一般情况观察：SA组大鼠活泼强壮,皮毛光亮,摄食正常,体重逐渐增加；BLM组死亡1只,有咳喘,皮毛无光泽,精神差,摄食减少,体重较SA组明显下降(P<0.001),后期体重略有增加。E-ES和w-ES组大鼠早期有咳喘,摄食减少,体重下降较BLM组减少(P<0.05)；L-ES组大鼠表现同BLM组,体重变化较BLM组无统计学差异。3.病理学改变：SA组各观察时期肺组织无明显炎症细胞浸润和纤维沉积。BLM组早期见肺泡间隔增宽,病灶区域炎症细胞浸润明显,少量胶原纤维沉积；晚期肺泡结构破坏明显,肺间质内大量蓝色胶原纤维沉积,炎症细胞浸润较早期减少。E-ES和W-ES组HE染色及Masson染色显示第7、14天肺泡炎较BLM组明显减轻(day7:P<0.001, day14:P<0.05),纤维化评分第14、28天较BLM组明显减低(day14:P<0.05, day28:P<0.001)。L-ES组大鼠肺泡炎及纤维化评分较BLM组大鼠无明显统计学差异。4.羟脯氨酸测定：SA组大鼠肺羟脯氨酸含量各观察时间段无明显变化。BLM造模后各观察时间段均较SA组明显升高(P<0.001)。E-ES和w-ES组羟脯氨酸含量较BLM组均明显下降(day7:P<0.01, day14和day28：P<0.001)。L-ES组羟脯氨酸含量较BLM组低,但尚无统计学意义(day28：P=0.09)5. MVD:SA组各观察时间段肺微血管密度无明显变化。BLM造模后第7天新生血管明显增多,第14和28天逐渐下降(P<0.001)。E-ES和w-ES组各观察时间段MVD较BLM组降低,L-ES组MVD较BLM组无明显变化。6. BALF炎症细胞计数及分类：SA组各观察时间段BALF炎症细胞计数及分类无变化。BLM造模后BALF中白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞计数均明显升高(P值均<0.05)。E-ES和w-ES组第7和14天白细胞总数、中性粒细胞及巨噬细胞计数较BLM组均明显下降(P<0.05),淋巴细胞计数在各观察时间段较BLM组无明显变化。L-ES组炎症细胞计数及分类较BLM组无统计学差异。7. PPI:SA组各观察时间段PPI无变化。BLM组PPI第7天明显升高,第14和28天逐渐下降(P<0.001)。E-ES和W-ES组PPI较BLM组降低(day7和day14:P<0.001, day28:P<0.05)。L-ES组PPI较BLM组无统计学差异。8. VEGF及VEGFR2mRNA与蛋白水平表达变化：BLM组各观察时段VEGF及VEGFR2mRNA水平较SA组明显增高,以第7天为著,第14和28天逐渐下降(day7和day14:P<0.001, day28:P<0.05). E-ES和W-ES组VEGF/VEGFR2mRNA表达较BLM组降低(P值均<0.05)。L-ES组VEGF及VEGFR2mRNA表达较BLM组无统计学差异。肺匀浆VEGF浓度及VEGFR2免疫组化评分变化同mRNA水平变化。9. TNF-α表达：SA组各观察时间段TNF-α表达水平无明显变化。BLM造模后TNF-α第7天明显升高,第14和28天逐渐下降(P<0.001)；E-ES和w-ES组TNF-α水平较BLM组在各观察时期均明显下降(P<0.001)；L-ES组第28天TNF-α水平较BLM组也下降(P<0.05)10. TGF-β1表达：BLM组TGF-β1表达较SA组明显升高,第14天最显著,第28天略有下降(P<0.001)；早期应用内皮抑素能显著抑制TGF-β1升高(P<0.001)；晚期应用内皮抑素后TGF-β1表达较BLM组降低,但尚无统计学差异(day28：P=0.142)11. pERK1/2和总ERK1/2:BLM造模后各组pERK1/2表达均较SA组明显升高(P值均<0.05)；F-ES和W-ES组pERK1/2表达第7、14天明显低于BLM组和L-ES组(day7:P<0.001, day14:P<0.05),第28天各组间无统计学差异：L-ES组和BLM组各观察时间段pERKl/2表达无显著差异。总ERKl/2在各组各观察时间段内表达稳定无显著变化。12. NF-κB激活：SA组NF-κB活化单位p65少量表达且各时期无明显变化。BLM造模后p65表达明显增多且第14天达到高峰,第28天有所下降。E-ES和w-ES组各观察时间段p65表达较BLM组明显下降(P<0.05)；L-ES组和BLM组各观察时间段p65表达尚无统计学差异(day28：P=0.139)结论：本实验通过大鼠气管内注入博来霉素后成功建立肺纤维化动物模型,肺组织病理特点说明可用于肺间质纤维化的研究。早期开始应用内皮抑素能明显抑制肺纤维化过程中异常的血管生成、炎症反应及胶原纤维沉积。内皮抑素能降低VEGF/VEGFR2基因及蛋白水平表达,能抑制ERK1/2磷酸化和NF-κB激活,减少促炎因子TNF-α及促纤维化因子TGF-β1生成,从而抑制异常血管生成及血管通透性增加,减轻肺泡炎症反应及BALF炎细胞渗出。基于以上可能机制,内皮抑素最终减少胶原沉积并改善肺纤维化形成,从而为深入研究临床工PF等肺纤维化疾病治疗措施提供更为广阔的前景。