犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬和其他肉食动物的一种急性、高度接触性传染病。近年来CDV的宿主范围不断扩大,已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩展到猫科、灵猫科等所有陆地食肉目动物及非人灵长类动物。近年来大熊猫种群的增加和栖息地的不断扩大使得大熊猫感染疾病的风险大大增加,犬瘟热已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的第一大传染病。2014年12月-2015年4月,陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心暴发圈养大熊猫犬瘟热疫情,共造成5只大熊猫死亡。本研究通过病原分离和抗体检测,首次证明CDV已经具备对大熊猫的跨种感染能力。疫苗免疫是预防CDV感染唯一的有效措施,但因现有弱毒疫苗对大熊猫具有致病性,目前尚无安全性高、稳定而有效的大熊猫用犬瘟热疫苗。本研究结合已有数据,针对大熊猫宿主的珍稀性和敏感性,开展了全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒亚单位疫苗的制备与免疫原性评估。鉴于雪貂用CDV重组金丝雀痘病毒活载体疫苗的安全性和有效性已经在2只大熊猫上通过免疫试验得到证实,本研究对商品化犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热活载体疫苗在大熊猫上进行了免疫效果评价。第一章:大熊猫犬瘟热病毒分离鉴定及遗传进化分析。通过对2014年12月-2015年4月陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心送检大熊猫样品的RT-PCR检测,发现22只大熊猫中共有6只CDV核酸检测阳性,其中5只后期表现全身抽搐的严重神经症状,抢救无效相继死亡。处于同一(龙龙、凤凤)或相邻圈舍(大宝、欣欣)的4只大熊猫相继发病死亡,表明直接接触或飞沫可能是其在大熊猫间相互传播的原因。将死亡大熊猫组织接种Vero/DogSLAM细胞系进行病毒分离培养,经电镜观察、细胞病变及CDV特异性抗体染色以及基因组序列测定等一系列分析确定所分离病毒为CDV,命名为giant panda/SX/2014。H基因遗传进化和氨基酸差异分析结果显示,giant panda/SX/2014仍属于流行的Asia-1型,但H蛋白出现了5个氨基酸突变:V26M、T213A、K281R、S300N和P340Q。此外,还发现决定与宿主SLAM受体结合的关键氨基酸位点549位aa突变为His(H),而非犬源分离株Tyr(Y)。推测giant panda/SX/2014 H蛋白Y549H替换可能导致CDV获得了跨种传播能力,且毒力增强,从而引发了此次大熊猫CDV的致死性感染。大熊猫“珠珠”CDV核酸检测阳性,但因体内存在CDV中和抗体(效价为1:128),未表现临床症状,至今仍存活,表明中和抗体可以使大熊猫免受CDV强毒的致死性攻击。提示可通过疫苗免疫接种预防大熊猫犬瘟热。第二章:犬瘟热灭活疫苗制备与免疫原性评估研究。由于CDV弱毒疫苗株可能会引起一些易感野生动物感染与发病,大熊猫也曾有因接种CDV弱毒疫苗发病死亡的报道。为此,本研究进行了犬瘟热灭活疫苗的制备。为保证疫苗免疫原剂量,本研究以荷兰Applikon细胞培养罐和GE公司Cytodexl球型微载体生产CDV,最高滴度可达107.8TCID50/mL。共选择β-丙内酯、甲醛2种灭活剂和3种不同的免疫剂量组合评估了犬瘟热灭活疫苗小鼠的免疫效果,结果显示甲醛灭活疫苗组免疫效果优于β-丙内酯灭活疫苗组,且免疫效果与剂量呈正相关,原液免疫组血清的中和抗体效价明显高于5×稀释组和10×稀释组,10×稀释组也可以诱导小鼠产生持久的中和抗体。为了进一步评价灭活疫苗的免疫原性,分别将其免疫水貂和狐狸,结果显示CDV甲醛灭活疫苗均可以诱导水貂和狐狸产生特异性中和抗体,显示出良好的免疫原性。在整个免疫试验中,未见任何免疫动物表现出犬瘟热的临床症状,结果表明:制备的犬瘟热灭活疫苗安全且具有良好的免疫原性。但其是否可以应用于大熊猫CDV预防,成为安全、有效的疫苗候选者还需进一步证实。第三章:犬瘟热病毒病毒样颗粒构建与实验免疫研究。VLPs是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的空心蛋白颗粒,可以诱导体液和细胞免疫,作为疫苗具有独特的优势。M蛋白是副黏病毒VLPs形成和出芽的主要驱动力,H蛋白是机体的主要保护性抗原,为此,本研究克隆giant panda/SX/2014 M和H基因,通过flashBAC杆状病毒表达系统分别拯救表达CDV M和H蛋白的重组杆状病毒,共感染昆虫细胞Sf9,即可自主装配成CDV VLPs并分泌到培养上清。电镜观察CDV VLPs大小约100nm左右,表面有纤突结构,呈典型的副黏病毒特征。Western Blot结果证实所构建CDV VLPs确由M与H蛋白组成。为初步评价CDV VLPs免疫原性,将包含CDV VLPs培养上清与佐剂混合后分别免疫水貂和狐狸,结果显示:CDV VLPs经两次免疫仍不能诱发水貂和狐狸产生可检测VNAs反应,可能需多次免疫或将VLPs纯化才能获得理想的免疫效果。第四章:犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热疫苗大熊猫实验免疫研究。金丝雀痘病毒重组活载体是一种非复制型载体,接种哺乳动物后外源基因可进行转录表达而不能形成感染性子代病毒,是一种安全有效的病毒载体。目前,梅里亚公司已成功研发多种表达CDV弱毒疫苗株F和H基因的重组金丝雀痘病毒活载体疫苗。本研究选择商品化犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热活载体疫苗“Recombitek?CDV”,分别按两种不同的免疫策略对来自某研究中心的23只大熊猫和某研究基地的37只大熊猫进行实验免疫,通过检测免疫动物的血清抗体效价评估该疫苗的免疫效果。结果显示:犬用重组犬瘟热疫苗可以诱导大熊猫产生中和抗体。经过两次疫苗免疫后,某研究中心的23只大熊猫无论有无预存抗体均全部能检测到CDV VNAs,平均值分别为65.1、33.1,范围为8-256;某研究基地的37只大熊猫中有9只可以检测到CDV VNAs,效价范围为8-32。进一步依据抗体阳性率和中和抗体水平高低确定最佳免疫策略为:初次免疫对有初始抗体的大熊猫接种1头份/只,无初始抗体的大熊猫接种2头份/只,3周后加强免疫一次,剂量为1头份/只。