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跨膜离子通道样基因家族(transmembrane channel-like gene family,TMC)编码一组具有8个跨膜区域(TM1-TM8)的跨膜蛋白,包括8个成员TMC1-TMC8,其在进化过程中具有较为保守的进化特性,预示着这类基因有着重要的细胞功能。但由于其难以外源表达、缺乏有效的特异性抗体和缺乏已知的蛋白结构等诸多原因,对TMC蛋白家族表达和功能的研究一直存在难以突破的瓶颈。最近有研究发现小鼠的TMC1和TMC2蛋白表达于耳蜗毛细胞的机械敏感性离子通道,是听觉产生过程中内耳毛细胞感受机械刺激并向神经冲动转化的重要基础,这一研究提示跨膜离子通道样TMC家族成员有可能是离子通道蛋白,并在动物感受外界刺激等方面发挥重要的作用。根据数据库提示以及我们的前期研究,发现TMC7 mRNA在大鼠神经系统以及外周初级感觉神经节DRG中有较高水平的表达,提示TMC7有可能在参与感觉神经系统感受对外界环境刺激的感知过程发挥重要作用。为证明这一推测,本论文通过CRISPR/cas9方法成功建立了TMC7基因敲除大鼠。一方面对TMC7基因敲除大鼠神经系统相关行为学表型进行系统的筛选,以确定TMC7蛋白可能的生理功能;另一方面,以TMC7基因敲除大鼠为可靠的对照,系统研究TMC7基因在神经系统的表达模式。由于目前仍缺乏针对TMC7蛋白的特异性抗体,本论文主要通过Basecope和RNAscope两种RNA原位杂交方法和单细胞PCR方法研究TMC7 mRNA在中枢和外周神经系统(特别是DRG神经元)中表达与分布情况。本研究可增进人们对TMC7在神经系统表达的全面系统性认识。第一部分TMC7 mRNA在大脑和DRG的表达分布研究目的:验证TMC7基因敲除大鼠的基因敲除结果,分析中枢神经系统与外周神经系统中TMC7 mRNA的表达量以及其分布特性。方法:(1)用CRISPR/cas9方法建立TMC7基因敲除大鼠,提取鼠尾DNA做基因型鉴定从而检测TMC7的敲除效果。同时使用RT-PCR验证敲除鼠DRG和耳蜗的TMC7表达丰度。(2)以TMC7基因敲除大鼠作为对照,通过Basescope技术检测WT大鼠中枢神经系统内TMC7 mRNA的表达及分布情况。(3)通过Basescope方法检测TMC7 mRNA在DRG内的表达及分布特征。结果:(1)小鼠出生后10天,剪脚趾标记并剪鼠尾提取基因组DNA,通过PCR扩增和凝胶电泳检测目的DNA条带,TMC7目标条带大约为620 bp,而WT条带约为466 bp。基因型为纯合子的大鼠可用做为实验组,WT鼠作为对照组。(2)中枢神经系统Basescope实验结果显示WT大鼠中枢神经系统中存在较多的TMC7 mRNA杂交信号点,而敲除大鼠各脑区没有杂交信号。TMC7 mRNA在中枢神经系统分布较为广泛,但不同脑区的表达率不同:其中在海马区域表达率为22.43%,纹状体区域为34.55%,中缝背核区域为40.04%,黑质区域为40.74%,边缘前皮质为47.44%,中脑腹侧被盖区为34.21%,小脑小叶区域为17.13%。这一结果提示TMC7在中脑部分表达和前额叶相对较多,中脑是视觉以及听觉的反射中枢,所有大脑皮层与脊髓间的上行及下行神经通路都经过中脑,同时,还可能是触觉、温度觉、痛觉的整合中枢。(3)外周感觉神经节DRG的Basescope实验结果显示WT大鼠DRG中存在较多的TMC7 mRNA杂交信号点,而敲除大鼠DRG中没有杂交信号达。TMC7 mRNA在DRG分布广泛,但值得注意的是TMC7较多表达在小直径神经元细胞中,而在大直径神经元中则分布较少,这提示其有可能与小直径神经元的生理调节活动有关。结论:TMC7 mRNA在大脑中有广泛分布,不同脑区TMC7 mRNA表达丰度不同,在中脑和边缘前皮质表达相对较多。TMC7 mRNA在DRG中也有广泛分布,特别是在小神经元中分布较多,提示其可能与小直径神经元的功能活动有关。第二部分TMC7 mRNA在DRG特异性分布研究目的:在转录本水平检测TMC7 mRNA在DRG中和其他各种分类标记基因的共表达情况,初步探究TMC7 mRNA在DRG神经元中细胞特征性分布和推测其相关功能。方法:(1)RNAscope技术观察TMC7 mRNA和DRG感觉相关标记基因如Nav1.8,TRPV1,CGRP,NEFH的共表达情况。(2)结合RNAscope和免疫荧光的方法,用mRNA探针标记TMC7的同时用蛋白抗体标记Piezo2,最后观察这两种基因在DRG细胞上的表达分布情况。(3)通过单细胞PCR方法测定TMC7 mRNA与DRG多种分子marker的共表达情况。结果:(1)RNAscope结果显示TMC7 mRNA阳性的DRG神经元中表达Nav1.8,CGRP,TRPV1,NEFH mRNA的细胞比例分别为62%,18.7%,51.3%,15%。提示TMC7生理功能可能与Nav1.8和TRPV1更具有相关性。(2)结合RNAscope和免疫荧光观察,结果显示Piezo2与TMC7的共表达相对较高。提示它们之间存在相关性。(3)利用single cell PCR技术,在DRG的单个细胞水平观察到TMC7mRNA的表达情况。根据细胞直径分布情况统计发现TMC7相对较多的表达在15～35μm的中小直径DRG神经元细胞上,这与第一部分Basecope的结果比较一致。而通过观察TMC7 mRNA与其他DRG神经元标记基因共表达情况发现TMC7 mRNA与GAT1、Sst、Mrgprb4、TRPV1等似乎有较多的共表达,而与NEFH共表达较少,这与前述的RNAscope的结果也十分吻合。结论:通过上述实验证明TMC7 mRNA与Nav1.8和TRPV1共表达多,而与CGRP和NEFH共表达较少,并且TMC7与Piezo2存在密切联系。single cell PCR的结果也验证了这几点。这些结果提示了TMC7有可能参与神经系统疼痛的传导及调节。