背景和目的老年黄斑病变(age-related macular degeneration, AMD)是全球范围内导致不可逆视力损伤的最常见原因，其中湿性AMD为国内外50岁以上人群低视力和致盲的重要原因，发病率不断增加。脉络膜新生血管(choroidal neovascularazition, CNV)形成是其危害视功能的主要病理基础和首要原因。在触发CNV的机制中，VEGF与抗血管生成因子之间的失衡尤为重要。VEGF是一种分泌性蛋白质，它可诱发血管生成，增加血管渗透性，引发炎症，而这些因素又与湿性AMD的发展进程密切相关。因此，众多学者在开发湿性AMD治疗药物时，都将VEGF当作潜在的治疗靶标，比如以适配子或者抗VEGF抗体片段形式出现的哌格太尼、兰尼单抗、Avastin等。而这些方法存在的问题主要包括不能在患部长效存在，即使应用各种缓释技术，由于局部微环境病理性VEGF长时间分泌，因此仍无法满足抑制VEGF的需求；尤为重要的是这些药物与VEGF结合后，由于代谢的困难，存在加重drusen的危险，所以抑制VEGF的产生将比降解或拮抗它更有利于AMD的治疗。同时脂褐质过载的RPE细胞功能障碍始终是AMD的一个重要的不利因素，在CNV的形成和发展中起着重要的作用。Bruch’s膜的粗糙，弹力纤维层变薄甚至断裂，RPE和Bruch’s膜粘附力下降，为CNV的生长提供了有利条件和促进因素，或者是诱因之一。因此，虽然目前血管内皮生长因子(vascular enthothelial growth factor，VEGF)抗体和光动力疗法等对CNV具有短期疗效，但对视功能恢复作用甚微。目前尚无能同时有效阻抑CNV和修复脉络膜-Bruch’s-RPE膜复合体的治疗措施。作为一种多功能的细胞外基质蛋白，Fibulin5(Fbln5)基因在AMD病程发展中，尤其在CNV形成过程中发挥重要作用。首先，在体内可调节细胞生长、运动及粘附，并且具有明显抑制新生血管的作用，虽然目前不能完全了解其对抗新生血管形成及VEGF作用的机制，但许多体内和体外研究证实了FBLN5可以从多个环节中对抗新生血管的形成，并且是通过RGD基序起作用的抑制新生血管形成的机理。其次，FBLN5能防止弹性蛋白病变的发生，同时充当载脂蛋白A和整合素的配体，FBLN5可通过钙依赖结合弹性蛋白的方式，促进弹性纤维组装并结合到微纤维系统中。FBLN5缺乏时由于深部弹力纤维结构的破坏，可引起皮肤、肺和脉管系统显著的异常。FBLN5的这两个重要作用恰好可以用来从不同环节抑制CNV，已有研究表明在眼部FBLN5可由RPE分泌，参与Bruch’s膜及部分玻璃膜疣的组装。另外，有系列研究发现在Fbln5基因突变与AMD具有相关性，并认为是其致病基因之一。Fbln5的突变改变了与弹性蛋白原的连接特性，可能导致Bruch’s膜正常弹性纤维的组装及稳定性异常；同时Fbln5的突变干扰了RPE与Bruch’s膜的正常粘附关系，这与AMD的血管模型的发病机制相符。因此，本课题假设：过表达FBLN5的RPE(Fbln5-RPE)视网膜下移植既能抑制VEGF产生又能补充RPE修复脉络膜-Bruch’s-RPE膜复合体，可能是治疗AMD的新手段。本研究内容是构建Fbln5慢病毒表达载体并转染RPE；体外检测其对脉络膜血管内皮细胞(Coroidal Endothelial Cells)增殖、迁移功能的影响及分子机制；将Fbln5-RPE移植到CNV动物模型的视网膜下腔，通过手术前后眼底血管荧光造影检测研究对CNV的抑制作用，由此，探讨RPE转染Fbln5后移植治疗CNV的效果和作用机制。研究方法1.应用Rat Fbln5全长cDNA质粒(pExpress-1-Fbln5)，构建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表达载体，转染原代培养Long Evans(LE)大鼠RPE，采用Quantitative real-timePCR(Q-PCR)方法，从基因水平检测慢病毒FBLN5的过表达。提取培养上清液，进行FBLN5的Western-Blot检测，检测分析所构建慢病毒FBLN5过表达和分泌至细胞外的能力。2. Fbln5-RPE对CECs增殖和迁移抑制作用及其机制的研究，实验分为三组，即单纯RPE组(空白对照)、GFP空载转染RPE(GFP-RPE)组(阴性对照)和Fbln5-RPE组(实验组)。采用Transwell共培养体系将上述三种RPE细胞分别与RF/6A猴脉络膜血管内皮细胞系(choroidal endothelial cells，CECs)进行共培养。按迁移模式共培养24小时后，检测穿透小室底膜的CECs数量和OD值，研究FBLN5抑制CECs迁移的作用。按增殖模式分别共培养24、48和72小时后，应用甲基噻唑基四唑细胞增殖检测法(Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium, MTT)和流式细胞周期检测法对Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用进行研究。同时，Q-PCR检测Fbln5-RPE对共培养CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表达的影响，探索其作用机制。3.建立Long Evans大鼠CNV模型，视网膜下腔移植Fbln5-RPE，研究其抑制体内CNV生成的作用，按转染RPE病毒种类的不同分为GFP-RPE组(阴性对照)和Fbln5-RPE组(实验组)。在移植前和移植后1、2、3、4周分别行眼底血管造影(FundusFluorescein Angiography, FFA)检查，分析移植前后CNV渗漏面积比值和计数比值，进行两组间的统计分析。结果第一部分Fibulin5慢病毒表达载体的构建及其转染RPE的研究1.成功构建pZlen-IRES-Fbln5-GFP慢病毒表达载体，基因测序结果显示完全正确，感染RPE的效率在70-80%左右。2.成功体外原代培养了LE大鼠RPE，纯度大于90%，具有富含色素、呈多角形的形态特点，广谱角蛋白DAB鉴定阳性，随着传代色素会越来越少、形态梭形变化。3. Fbln5-RPE中Fbln5表达量是对照组的28倍以上。培养上清液WB检测发现FBLN5相对于对照组显著过表达，并能高效分泌至细胞外。第二部分Fbln5对脉络膜血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用及其机制研究1.体外共培养迁移抑制试验发现Fbln5-RPE可显著抑制CECs迁移透过Transwell小室底膜的数量(n=5，P <0.01)。而空载体对照组没有这种效果(n=5， P>0.05)。2.体外共培养第1、2、3天，MTT结果显示相对于对照组，Fbln5-RPE均可显著抑制CECs的OD值(n=5，P <0.05)，提示Fbln5-RPE具有抑制CECs增殖的作用。阴性对照组和空白对照组之间均无统计学差异(n=5， P>0.05)。3.体外共培养第1、2、3天，Fbln5-RPE均可显著抑制CECs细胞S期的比例和细胞增殖指数，其增殖显著受到抑制(n=3，P <0.05)，进一步证明Fbln5-RPE抑制CECs增殖的作用。阴性对照组和空白对照组之间均无统计学差异(n=3， P>0.05)。而各个时间点CECs的凋亡系数三组之间均无统计学差异(n=3， P>0.05)。4.体外共培养第1、2、3天，Q-PCR发现相对于两个对照组，Fbln5-RPE下调了CECs中CXCR4，VEGF，TGFB1基因表达水平，相对表达倍数统计分析有显著差异(n=3，P <0.01)，提示Fbln5-RPE下调CXCR4，VEGF可能是抑制CECs增殖和迁移的作用机制。第三部分激光诱导CNV模型视网膜下腔移植Fbln5-RPE的体内研究1.成功建立激光诱导LE大鼠CNV模型，1-5周FFA显示70%左右的激光点有荧光素渗漏，同期眼球冰冻切片可见CNV形态。2.移植后1、2、3、4周后， GFP绿色荧光阳性细胞在神经视网膜下腔排列成带状，并向视网膜层间迁移。移植后第2、3、4周，CNV渗漏面积比值和CNV数量比值，实验组均低于对照组(n=3，P <0.05)，提示Fbln5-RPE视网膜下腔移植有抑制CNV的作用。全文结论与学术意义1.成功构建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表达系统并率先应用到眼科新生血管性疾病的研究中。充分利用了慢病毒长期、高效和整合基因组的优点，为进一步的实验尤其是需要较长期观察的体内试验提供了有利条件。实验结果分别从基因水平和蛋白水平证明了FBLN5能高效表达于RPE细胞并且分泌至细胞外，为进一步的共培养实验和体内移植实验提供了方法学基础。2.应用Transwell共培养体系，从基质胶迁移实验、MTT、细胞周期、增殖指数和凋亡系数等多个层面充分证实了Fbln5-RPE能显著抑制共培养CECs的增殖和迁移，并发现其作用机制可能是通过下调共培养CECs中VEGF和CXCR4表达来实现。本研究提示Fblin5-RPE可能具有抗CNV形成的作用。3.成功建立激光诱导大鼠CNV模型，将Fbln5-RPE移植于动物模型视网膜下腔，率先发现Fbln5-RPE可显著降低CNV荧光素渗漏面积和减少CNV数量，证实了Fbln5-RPE移植可抑制CNV生成。综合体外和体内试验结果，本研究提示Fbln5-RPE移植为临床治疗CNV提供了一定的理论基础，有望成为一种治疗CNV性AMD的新策略。