目的 晶体渗透压的适当调节对于维持晶状体纤维有序发育及保持晶状体透明性有必要意义。在高渗刺激下，多种组织积聚有机小分子渗透压物质，如甘氨酸、甜菜碱、肌醇和山梨糖等。对比高浓度电解质，小分子有机溶质不影响酶及其他细胞内大分子的活性。多种参与细胞内有机小分子渗透压物质合成及转送的基因的启动子5’端具有渗透压反应元件的一致序列。渗透压反应元件结合蛋白在高渗作用下转位至细胞核内，结合至下游基因的渗透压反应元件部位，通过顺式调节，促进这些小分子渗透压物质的合成及利用，从而保持细胞内渗透压稳态。 渗透压反应元件不但存在于一些调节渗透压物质的基因等的启动子5’端，渗透压反应元件结合蛋白也控制另外一些基因如尿素转运子，热休克蛋白70，并在高渗刺激下，促进它们的表达。说明它在细胞中的作用并不只限于渗透压调节。 渗透压反应元件结合蛋白mRNA在多种培养细胞中和检测的生物组织样品中都有低水平表达，说明渗透压反应元件结合蛋白在生理状态下或等渗组织中也有作用。而且渗透压反应元件结合蛋白在胚胎期包括眼球在内的多种组织中较成年组织高度表达说明它在胚胎期细胞发育中可能起到重要作用。 渗透压反应元件结合蛋白含有DNA结合结构域和反式活化域，OREBP通过DNA结合域结合至一些基因的5’端渗透压反应元件，其反式活化域调节这些基因的转录效率，从而调节下游基因的表达。在细胞培养实验中，超表达缺乏反式活化域，只包含DNA结合域的截断型OREBP，会竞争性抑制正常内生性OREBP与所调控基因的表达，表现为显性失活作用。 渗透压反应元件结合蛋白虽然在培养细胞中的作用正在被人们逐步认识，而它在生物组织中的具体作用尚有许多不明之处，它在晶状体中的作用及机制仍未见报道。但由于晶状体作为一种特殊器官，其渗透压稳态调节对于维持透明性及正常生理功能非常重要，因此，渗透压反应元件结合蛋白有很大可能在晶状体的相关基因表达中起重要调节作用。转基因技术经多年研究发展，作为研究基因在体作用的手段已经很成熟。本实验的主要目的就是通过特异性在小鼠晶状体超表达显性失活渗透压反应元件结合蛋白，研究渗透压反应元件结合蛋白在小鼠晶状体发育及白内障形成中的分子生物学作用及其机制。方法 本实验通过应用转基因技术，通过显微注射将多拷贝显性失活渗透压反应元件结合蛋白DNA片段导入小鼠基因组，使其特异性表达于小鼠晶状体。建立转基因先证者后，通过聚合酶链反应检测基因组中的转基因，并建立稳定表达转基因的鼠系。 通过裂隙灯显微镜观察晶状体的发育及转基因鼠白内障发展。解剖显微镜下观察比较4周转基因鼠及无转基因鼠晶状体并测量晶状体干重和湿重。 通过免疫组化方法分析胚胎期内源性渗透压反应元件结合蛋白及转基因表达的截断型渗透压反应元件结合蛋白分布及晶状体形态学变化。 利用Real一Time’定量RT一PCR测量晶体醛糖还原酶mRNA的表达水平。 并利用晶状体培养观察高渗刺激下，鼠晶状体OREBP对渗透压物质调节作用，同样利用Real一Time定量RT一PCR测量晶体醛糖还原酶mRNA的表达水平及HPLC检测晶状体小分子渗透压物质甜菜碱和甘氨酸水平。结果 成功建立稳定超表达显性失活渗透压反应元件结合蛋白转基因鼠系，转基因受鼠QA晶体蛋白启动子调控，从而保证在晶状体的特异表达。 从2周左右小鼠开睑时即可观察到转基因鼠出现较致密核性白内障，晶状体皮质未见侵犯。解剖显微镜下观察比较4周转基因鼠及无转基因同窝小鼠晶状体，转基因鼠的直径大小均低于同窝无转基因鼠晶状体，晶状体湿重及干重也低于同窝无转基因鼠晶状体。 分别应用兔抗鼠多克隆抗内生性渗透压反应元件结合蛋白抗体和鼠单克隆抗转基因标记的FLAG抗体对胚胎第11 .5，13.5、16.5及18.5的晶状体切片进行免疫组化方法分析，可见内源性渗透压反应元件结合蛋白在各个时期的晶状体上皮细胞和纤维细胞均有表达，在纤维细胞的表达11.5天和13.5天集中于纤维细胞的前部和接近后囊部，16.5天时弥漫分布于纤维细胞，但前部初级纤维细胞表达明显强于相邻的次级纤维细胞，接近后囊部无表达，18.5天表达弥漫分布，初级纤维细胞和次级纤维细胞表达未见明显差别。转基因鼠的内源性渗透压反应元件结合蛋白表达量和分布和非转基因鼠晶状体基本相似，但由于转基因鼠自胚胎第16.5天出现空泡，所以16.5天时无初级纤维细胞和次级纤维细胞的不同水平分布的特点。自胚胎第13.5天，转基因鼠晶状体纤维细胞中出现转基因的表达，而晶状体上皮细胞中始终未见转基因的表达。胚胎第13.5天转基因的表达只见于部分初级纤维细胞的细胞质及细胞核，而胚胎第16.5天，转基因在除刚开始延伸的纤维细胞外的几乎所有初级和次级纤维细胞内表达，外侧部分次级纤维细胞表达集中于细胞核，但很快遍布于全细胞质，初级纤维细胞中表达较次级纤维细胞弱，且以细胞核内为主。转基因鼠两者之间及晶状?