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猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,MPS)是一种慢性呼吸道传染病,也称为猪气喘病或猪地方性肺炎(swine enzootic pneumonia,EP)。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起MPS的主要病原体。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是造成猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原体。临床上Mhp常会与PCV2等病原体协同感染,增加相关疾病的严重性和潜在的持久性,最终导致死亡率上升。目前,防控Mhp和PCV2的主要手段是疫苗免疫。但传统的商业疫苗以灭活疫苗和弱毒疫苗为主,其普遍存在免疫原性不好、免疫反应持续时间不稳定或者毒力容易回复等缺点。而多联疫苗可实现接种一针预防多种疾病的目的,尤其在疫病长期共存的情况下,联苗将成为未来防疫的主要类型。通过基因工程方法制备的疫苗能同时表达多种疾病的抗原蛋白,达到联合疫苗的使用效果,同时也解决了常规联苗抗原组分相容性的问题。但目前可同时预防Mhp和PCV2两种病原体的二联基因工程疫苗未见报道。基于此,本研究的目的是通过昆虫杆状病毒表达系统的表面展示技术,在杆状病毒囊膜上同时表达Mhp的P97R1、P46、P42嵌合体蛋白与PCV2的Cap蛋白。并将此重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-Cap作为活病毒疫苗免疫动物,初步分析其在小鼠以及仔猪上的免疫效果。为了检测蛋白表达和动物免疫效果,首先利用原核表达系统制备了 rP97R1、rP46、rP42和Cap重组蛋白,将rP97R1、rP46、rP42蛋白免疫新西兰大白兔分别制备了抗血清。通过间接ELISA分别检测了三种纯化后多抗效价,均达到1:400000以上,可供后续实验使用。然后构建了一种携带有mCherry和 EGFP双荧光标签的重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-mCherry-Cap-EGFP,感染Sf9细胞后进行直接荧光观察以及间接免疫荧光、免疫电镜等实验的鉴定,证实了融合有mCherry标签的P97R1P46P42和融合有EGFP标签的Cap蛋白能表达并定位于细胞膜上,同时也能展示在杆状病毒囊膜表面。在此基础上,对含有荧光标签的重组杆状病毒载体去标签改造,得到重组杆状病毒rvAc-P97R1P46P42-Cap。将此重组杆状病毒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和脾淋巴细胞增殖实验检测表明,与PBS、野生型杆状病毒rvAc-dual以及商业疫苗相比,重组杆状病毒免疫后能引发小鼠产生特异性的IgG抗体(P<0.001),脾淋巴细胞在被相应刺激原刺激后能产生显著的增殖效果(P<0.001),且免疫血清能与两种病原体的野生株发生特异性的抗原-抗体反应。由此结果可知,此重组杆状病毒免疫小鼠后能够引发小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫效应。在此基础上,重组杆状病毒免疫仔猪进一步进行验证,通过对免疫猪的血清进行ELISA检测后发现其与野生型病毒相比,同样能引发猪的机体产生显著水平的特异性抗体和细胞因子IL-4和TNF-γ(P<0.001)。说明重组杆状病毒免疫仔猪后同样能够引发特异性的体液免疫和细胞免疫效应。由此证明,重组杆状病毒rvAc-P97R 1 P46P42-Cap在小鼠和仔猪中都具有较好的免疫原性。本研究通过杆状病毒表面展示系统同时表达了 Mhp三种抗原(P97R1、P46和P42)的嵌合体蛋白和PCV2的Cap蛋白,并在小鼠和仔猪免疫实验中证实其具有较好的免疫原性,为进一步研制可同时预防Mhp和PCV2的二联基因工程疫苗奠定了基础。