肿瘤血管生成系统已成为目前肿瘤治疗的新靶点,通过破坏或抑制肿瘤的新生血管生成,从而抑制肿瘤的形成和发展,是一种有效的“饥饿疗法”。Pro-EMAPⅡ又称p43蛋白,是内皮单核细胞活化多肽Ⅱ(EMAPⅡ)的前体。近年来研究表明,p43蛋白在体内外均显示出良好的新生血管抑制作用,同时可以调控多种细胞因子的表达从而引发炎症反应,有望被开发为一种新的抗肿瘤药物。更多的研究表明,p43蛋白与EMAPⅡ相比,具有更多的生物学功能,能够调控多种细胞因子的表达。从结构上考虑,p43蛋白与EMAPⅡ在生物学功能上存在的差异,唯一的差别在于其N末端结构域的存在,但目前对于N末端结构域的结构和功能研究相对较少。有研究报道p43蛋白的N末端结构域具有免疫增强剂的作用,但N端结构域是以何种机制促进p43蛋白抑制新生血管作用的提高,是其对EMAPⅡ的辅助作用,还是二者作为一个整体来发挥作用,目前尚无文献报道。为了对其进行进一步研究,我们构建了p43蛋白N末端结构域(p43N)和C末端结构域(p43C)原核表达载体,并实现了在大肠杆菌中高效表达,通过Ni-agarose亲和层析及SP离子交换层析两步纯化获得纯度较高的目的蛋白。将纯化的目的蛋白作用于内皮细胞,利用管腔形成实验、细胞迁移实验及双夹心ELISA方法鉴定了它们的生物学活性,并且比较等摩尔浓度的p43蛋白、p43N、p43C及p43N+p43C的生物学活性差异。活性鉴定实验表明：在抗血管生成活性方面,p43N和p43C均具有抑制内皮细胞管腔形成及迁移的作用；在细胞因子活性方面,两者均具有上调IL8和MCP-1细胞因子表达的作用；等摩尔浓度下,p43N的抗血管活性较弱,但具有较强的促细胞因子表达的活性；p43N和p43C共同作用时,生物活性高于单独作用。由此我们认为p43N对p43C具有一定的辅助作用；p43蛋白发挥抗血管活性不是通过p43N或者p43C其中之一,而是有可能作为一个整体发挥的；同时抗血管生成活性可能不是p43N的主要作用,其可能主要作为一种免疫增强剂诱导多种细胞因子和炎症因子产生,从而辅助p43C促进p43蛋白抗血管活性提高。生物学功能的差异首先体现在基因水平上的变化,为了研究p43N与p43C蛋白作用人微血管内皮细胞HMEC-1相关基因的表达差异,我们利用实时RT-PCR技术,研究了HMEC-1细胞经p43蛋白(50μg/mL)、p43N与p43C作用12h后,IL8、IL1β、IRF7、IFI16、MX1、VCAM1、STAT1及TNFRSF9这八个基因的表达差异。结果表明,p43N上调这八个基因的mRNA最明显,且p43N作用白介素类基因以(IL8、IL1β)及干扰素类相关基因(IRF7、IFI16、MX1)最显著,由此我们推测p43N可能通过上调免疫相关基因的表达从而激活相关信号通路,进而发挥一定的生物学功能,但其具体作用机制还需深入研究。综上所述,我们成功构建、表达了p43N与p43C蛋白,并通过一定的纯化方法获得纯度较高的目的蛋白。通过内皮细胞的管腔形成实验、细胞迁移实验及双夹心ELISA方法鉴定了它们的生物学活性,并比较等摩尔浓度下,p43蛋白、p43N、p43C及p43N+ p43C的活性差异。通过实时RT-PCR技术,分析了p43N与p43C作用内皮细胞相关基因的表达差异,为进一步揭示p43N的作用机制奠定了基础。