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脱氢酶作为一种氧化还原酶,在六大类酶学分类中属于第一类,在生物传感器、辅酶再生、多酶催化等方面具有广泛的应用。为了建立脱氢酶偶联催化体系,实现辅酶高效循环再生,我们进行了从基本性质到应用层面的一系列研究。论文的研究内容涉及一种脱氢酶的鉴定和表征,脱氢酶与ssDNA高效交联反应体系的建立和ssDNA介导脱氢酶偶联反应方法实现辅酶循环的研究。主要工作包括三个部分:1、对源于Ecoli MG1655由orf382编码被注释为脱氢酶的蛋白质进行了表征,对其酶学性质和结构进行了研究。我们测定了酶的底物谱以及对不同底物的米氏常数(乙醇Km=222.5μM,L-苏氨酸Km=11.29μM),并构建和分析了突变体菌株的表型,证实此酶为L-苏氨酸脱氢酶(L-Threonine Dehydrogenase, LTDH),可能在苏氨酸代谢中发挥作用。以L-苏氨酸为底物进行后续研究,结果表明,其最适温度为39℃,最适pH为pH9.8,更倾向于利用NAD+(而非NADP+)作为催化氧化的辅酶,等电点为pH5.4。此外,利用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)进行金属离子分析(Fe,Zn),用圆二色谱法进行了的二级结构的分析研究。2、以来自噬菌体ΦX174的蛋白protein A*(proA*, protein ID:NP040704)为融合标签与脱氢酶形成融合蛋白,利用proteinA*具有识别、切割并催化特定序列的ssDNA与自身酪氨酸残基(Tyr)通过形成磷酸二酯键连接的特性建立了蛋白质-ssDNA高效交联方法。反应在交联缓冲液中进行,交联温度为37℃,时间为10min,制得蛋白质-ssDNA交联物。3、通过建立的蛋白质-ssDNA交联方法,实施了甘油脱氢酶和谷氨酸脱氢酶在温和条件下与ssDNA的交联反应,完成蛋白质-ssDNA交联物的制备。碱基的互补配对使我们可以通过设计互补的ssDNA来指导脱氢酶-ssDNA交联物的空间排布,实现脱氢酶复合体组装,创建可编程的自组装多酶协同催化体系。实验结果显示,融合protein A*标签能够提高原脱氢酶的比活(GlyDH-A*:GlyDH=116.0%; GluDH-A*:GluDH=105.2%)。另外,通过对以甘油和a-酮戊二酸为底物的酶偶联反应体系的产物谷氨酸的高效液相分析,我们发现酶偶联反应体系的催化效率是单一酶催化体系31.2到53.9倍,这也证实了在空间自组装反应体系中,由于临近效应而存在底物通道机制。本研究展示了一种增强氧化还原反应辅酶循环的新策略。