论文部分内容阅读
磷缺乏是限制植物生长的重要因子之一。丛枝菌根作为最古老、最普遍的有益共生真菌，可与约90％的维管束植物形成共生体系，促进植物对多种矿质元素的吸收，尤其是磷。为探明小麦与丛枝菌根的共生关系以及挖掘参与菌根共生的磷转运蛋白，本研究首先建立了小麦在不同磷浓度下与丛枝菌根的共生体系，并进行RNA-seq测序分析;其次，对小麦PHT1家族成员进行表达模式分析，获得了4个丛枝菌根诱导的PHT1新基因;最后，利用病毒诱导的基因沉默和酵母双杂交技术对TaPT29-6A基因功能进行验证，主要研究结果如下:
1.本研究在高磷和低磷条件下建立了小麦与丛枝菌根的共生体系，对不同处理的12个样品（高磷条件下共生:Ta_HPFM，低磷条件下共生:Ta_LPFM，高磷条件不共生:Ta_HPCK，低磷条件下不共生:Ta_LPCK，每个处理3个重复）进行RNA-seq测序，测序数据分析显示Ta_HPFM vs.Ta_HPCK和Ta_LPFM vs.Ta_LPCK组合分别有960个（其中959个基因上调，1基因下调）和744个（全部上调）差异表达基因，这些基因均参与了基础代谢、次生代谢产物以及矿质营养吸收等相关通路;发现9个PHT1蛋白受丛枝菌根诱导上调表达，表明部分小麦PHT1蛋白参与了小麦与丛枝菌根的共生。
2.本研究鉴定出35个PHT1家族成员，对其进行系统进化分析发现35个基因分别聚在5个进化支上，有多个新基因与小麦和其他物种已知丛枝菌根诱导的PHT1基因聚在同一分支上;序列分析表明，小麦PHT1基因家族有11种基序结构和5种外显子-内含子结构，均含有PHT1蛋白的标志性结构基序;染色体定位及基因复制模式分析结果表明，34个小麦PHT1基因不均匀分布在13条染色体上，复制模式分析表明，小麦PHT1基因家族主要通过片段重复和串联重复事件进行扩增。
3.磷高效小麦品种周麦26对摩西管柄囊霉和地表球囊霉的响应属于消极的共生反应，抑制了由根毛介导的直接磷吸收途径，降低了小麦磷含量;3个已知丛枝菌根诱导基因TaPht-myc、TaPT15-4B（TaPT11）和TaPT19-4D（TaPT10），以及4个新的丛枝菌根诱导基因（TaPT3-2D、TaPT11-4A、TaPT29-6A和TaPT31-7A）在丛枝菌根共生小麦的根系中显著上调表达;上述7个基因的表达量在不同病原菌侵染不同阶段有差异。TaPT29-6A蛋白亚细胞定位分析表明，TaPT29-6A定位在质膜上;采用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默技术对TaPT29-6A基因功能进行分析，结果显示，沉默TaPT29-6A提高了小麦植株的磷含量，并减少了小麦根系菌根定殖和丛枝的数量，增加了小麦对活体寄生、半活体寄生和腐生真菌感病性，说明该基因是菌根共生、磷吸收及免疫反应中的关键基因。
4.本研究构建了低磷条件下与菌根共生的小麦根系酵母cDNA文库，并构建了TaPT29-6A基因的诱饵载体pGBKT7-TaPT29-6A，该基因在酵母中无毒性和自激活，以TaP T29-6A基因为诱饵，筛选低磷诱导的小麦根系酵母双杂交cDNA文库，获得了TaPT29-6A的4个候选互作蛋白，分别是小麦PHT1家族其他成员和质体合成相关蛋白，推测PHT1蛋白可能以蛋白复合体的形式发挥功能。
本研究结果可为小麦与丛枝菌根共生影响磷的吸收利用提供一定的理论依据，丰富了小麦PHT1基因响应丛枝菌根的功能，同时也为提高小麦磷的吸收、利用效率提供理论依据。
1.本研究在高磷和低磷条件下建立了小麦与丛枝菌根的共生体系，对不同处理的12个样品（高磷条件下共生:Ta_HPFM，低磷条件下共生:Ta_LPFM，高磷条件不共生:Ta_HPCK，低磷条件下不共生:Ta_LPCK，每个处理3个重复）进行RNA-seq测序，测序数据分析显示Ta_HPFM vs.Ta_HPCK和Ta_LPFM vs.Ta_LPCK组合分别有960个（其中959个基因上调，1基因下调）和744个（全部上调）差异表达基因，这些基因均参与了基础代谢、次生代谢产物以及矿质营养吸收等相关通路;发现9个PHT1蛋白受丛枝菌根诱导上调表达，表明部分小麦PHT1蛋白参与了小麦与丛枝菌根的共生。
2.本研究鉴定出35个PHT1家族成员，对其进行系统进化分析发现35个基因分别聚在5个进化支上，有多个新基因与小麦和其他物种已知丛枝菌根诱导的PHT1基因聚在同一分支上;序列分析表明，小麦PHT1基因家族有11种基序结构和5种外显子-内含子结构，均含有PHT1蛋白的标志性结构基序;染色体定位及基因复制模式分析结果表明，34个小麦PHT1基因不均匀分布在13条染色体上，复制模式分析表明，小麦PHT1基因家族主要通过片段重复和串联重复事件进行扩增。
3.磷高效小麦品种周麦26对摩西管柄囊霉和地表球囊霉的响应属于消极的共生反应，抑制了由根毛介导的直接磷吸收途径，降低了小麦磷含量;3个已知丛枝菌根诱导基因TaPht-myc、TaPT15-4B（TaPT11）和TaPT19-4D（TaPT10），以及4个新的丛枝菌根诱导基因（TaPT3-2D、TaPT11-4A、TaPT29-6A和TaPT31-7A）在丛枝菌根共生小麦的根系中显著上调表达;上述7个基因的表达量在不同病原菌侵染不同阶段有差异。TaPT29-6A蛋白亚细胞定位分析表明，TaPT29-6A定位在质膜上;采用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默技术对TaPT29-6A基因功能进行分析，结果显示，沉默TaPT29-6A提高了小麦植株的磷含量，并减少了小麦根系菌根定殖和丛枝的数量，增加了小麦对活体寄生、半活体寄生和腐生真菌感病性，说明该基因是菌根共生、磷吸收及免疫反应中的关键基因。
4.本研究构建了低磷条件下与菌根共生的小麦根系酵母cDNA文库，并构建了TaPT29-6A基因的诱饵载体pGBKT7-TaPT29-6A，该基因在酵母中无毒性和自激活，以TaP T29-6A基因为诱饵，筛选低磷诱导的小麦根系酵母双杂交cDNA文库，获得了TaPT29-6A的4个候选互作蛋白，分别是小麦PHT1家族其他成员和质体合成相关蛋白，推测PHT1蛋白可能以蛋白复合体的形式发挥功能。
本研究结果可为小麦与丛枝菌根共生影响磷的吸收利用提供一定的理论依据，丰富了小麦PHT1基因响应丛枝菌根的功能，同时也为提高小麦磷的吸收、利用效率提供理论依据。