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目的：探索UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡的作用以及可能的调控机制，为光损伤性皮肤病的预防及治疗提供新思路。
方法：1、凋亡模型建立：成纤维细胞培养至铺满板底70%-80%时进行UVA处理。本实验小组前期已设置不同的UVA剂量组，通过对细胞活性和细胞凋亡的检测，最终确定UVA的照射剂量为8J/cm2并成功构造UVA诱导成纤维细胞凋亡的适宜模型。2、UVA诱导的胞内ROS水平检测：设置照射平均功率为15mw/cm2，根据公式（照射时间=照射剂量/平均功率）得出8J/cm2剂量的需照射时间为533秒。细胞经UVA照射后分别培养1h、2h、3h和4h。培养后加入DCHF-DA探针孵育30分钟，通过流式细胞仪检测ROS水平。3、UVA诱导的ROS对细胞自噬的作用：将成纤维细胞分为对照组、UVA组和NAC组。UVA组仅照光处理，NAC组先予5mmol/L NAC预处理2h后再行照光处理。各组上述处理后继续培养4h，通过Western blot检测LC3和P62蛋白的含量变化。4、探索细胞自噬对细胞凋亡的影响：将成纤维细胞设置为对照组、UVA组、3-MA组和RAPA组。对照组不经特殊处理，UVA组仅行照光处理，RAPA组先予100nmol/L RAPA预处理2h再行照光处理，3-MA组予50umol/L3-MA预处理2h再行照光处理。各组经上述处理后立即加入2ml培养基继续培养4h并于倒置显微镜下拍照记录细胞形态学变化。各组通过Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测凋亡，通过CCK-8试剂盒测定细胞活性，通过Western blot检测LC3、P62和Cleaved caspase3的表达水平。5、Nrf2信号通路研究：成纤维细胞分为对照组、UVA组、UVA+NAC组和UVA+ML385组。通过Western bolt检测核Nrf2蛋白、P62蛋白和Cleaved Caspase3蛋白的表达水平。
结果：1、予以8J/cm2UVA照射成纤维细胞后继续培养，1h组检测到胞内ROS水平变化较对照组差异不具有统计学意义（P=0.152＞0.05），2h、3h以及4h组胞内ROS水平逐渐升高（P＜0.01）。2、UVA照射成纤维细胞4h后，胞内自噬相关蛋白LC3II/I的比值增大，P62表达降低（P＜0.01）。给予5mmol/L抗氧化剂NAC预处理组的胞内LC3II/I比值虽也较对照组高，但低于UVA组。且其P62的表达虽低于对照组但高于UVA组。3、成纤维细胞经8J/cm2的UVA照射4h后，细胞间隔增宽，部分细胞长突部位缩短，细胞活性下降（P＜0.01），细胞凋亡率升高（P＜0.01），胞内凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达水平上调（P＜0.01）。而先予100nmol/L RAPA预处理2h后再完成光照，虽与对照组相比细胞增殖活性下降、细胞凋亡率上升、胞内Cleaved caspase3蛋白增多，但其与UVA组相比细胞活性升高、细胞凋亡率下降、胞内Cleaved caspase3蛋白减少。自噬抑制剂3-MA组各检测结果趋势与RAPA组相反。差异均具有统计学意义。4、UVA组胞核Nrf2表达明显较空白对照组增多(P＜0.01）。经NAC预处理组发现核Nrf2和胞浆Cleaved caspase3蛋白较单纯UVA组下降，而P62蛋白表达增加。予ML385阻断Nrf2入核，与UVA组相比，UVA+ML385组胞核Nrf2下降，胞浆P62蛋白减少，而Cleaved caspase3蛋白增加。各组差异均具有统计学意义。
结论：1、UVA能诱导成纤维细胞氧化应激。2、UVA通过诱导氧化应激激活人皮肤成纤维细胞自噬。3、细胞自噬可抑制UVA诱导的成纤维细胞凋亡。4、Nrf2参与调控UVA诱导的成纤维细胞自噬和细胞凋亡过程。
方法：1、凋亡模型建立：成纤维细胞培养至铺满板底70%-80%时进行UVA处理。本实验小组前期已设置不同的UVA剂量组，通过对细胞活性和细胞凋亡的检测，最终确定UVA的照射剂量为8J/cm2并成功构造UVA诱导成纤维细胞凋亡的适宜模型。2、UVA诱导的胞内ROS水平检测：设置照射平均功率为15mw/cm2，根据公式（照射时间=照射剂量/平均功率）得出8J/cm2剂量的需照射时间为533秒。细胞经UVA照射后分别培养1h、2h、3h和4h。培养后加入DCHF-DA探针孵育30分钟，通过流式细胞仪检测ROS水平。3、UVA诱导的ROS对细胞自噬的作用：将成纤维细胞分为对照组、UVA组和NAC组。UVA组仅照光处理，NAC组先予5mmol/L NAC预处理2h后再行照光处理。各组上述处理后继续培养4h，通过Western blot检测LC3和P62蛋白的含量变化。4、探索细胞自噬对细胞凋亡的影响：将成纤维细胞设置为对照组、UVA组、3-MA组和RAPA组。对照组不经特殊处理，UVA组仅行照光处理，RAPA组先予100nmol/L RAPA预处理2h再行照光处理，3-MA组予50umol/L3-MA预处理2h再行照光处理。各组经上述处理后立即加入2ml培养基继续培养4h并于倒置显微镜下拍照记录细胞形态学变化。各组通过Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测凋亡，通过CCK-8试剂盒测定细胞活性，通过Western blot检测LC3、P62和Cleaved caspase3的表达水平。5、Nrf2信号通路研究：成纤维细胞分为对照组、UVA组、UVA+NAC组和UVA+ML385组。通过Western bolt检测核Nrf2蛋白、P62蛋白和Cleaved Caspase3蛋白的表达水平。
结果：1、予以8J/cm2UVA照射成纤维细胞后继续培养，1h组检测到胞内ROS水平变化较对照组差异不具有统计学意义（P=0.152＞0.05），2h、3h以及4h组胞内ROS水平逐渐升高（P＜0.01）。2、UVA照射成纤维细胞4h后，胞内自噬相关蛋白LC3II/I的比值增大，P62表达降低（P＜0.01）。给予5mmol/L抗氧化剂NAC预处理组的胞内LC3II/I比值虽也较对照组高，但低于UVA组。且其P62的表达虽低于对照组但高于UVA组。3、成纤维细胞经8J/cm2的UVA照射4h后，细胞间隔增宽，部分细胞长突部位缩短，细胞活性下降（P＜0.01），细胞凋亡率升高（P＜0.01），胞内凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达水平上调（P＜0.01）。而先予100nmol/L RAPA预处理2h后再完成光照，虽与对照组相比细胞增殖活性下降、细胞凋亡率上升、胞内Cleaved caspase3蛋白增多，但其与UVA组相比细胞活性升高、细胞凋亡率下降、胞内Cleaved caspase3蛋白减少。自噬抑制剂3-MA组各检测结果趋势与RAPA组相反。差异均具有统计学意义。4、UVA组胞核Nrf2表达明显较空白对照组增多(P＜0.01）。经NAC预处理组发现核Nrf2和胞浆Cleaved caspase3蛋白较单纯UVA组下降，而P62蛋白表达增加。予ML385阻断Nrf2入核，与UVA组相比，UVA+ML385组胞核Nrf2下降，胞浆P62蛋白减少，而Cleaved caspase3蛋白增加。各组差异均具有统计学意义。
结论：1、UVA能诱导成纤维细胞氧化应激。2、UVA通过诱导氧化应激激活人皮肤成纤维细胞自噬。3、细胞自噬可抑制UVA诱导的成纤维细胞凋亡。4、Nrf2参与调控UVA诱导的成纤维细胞自噬和细胞凋亡过程。