脓毒症(Sepsis)是以多器官功能衰竭和心血管抑制为特征的全身炎症反应综合征,其死亡率高,预后差且治疗费用高,目前已成为非心血管重症病房中最常见的死亡原因。目前对脓毒症的研究大都聚焦于促炎与抗炎、氧化与抗氧化以及凝血与纤溶等诸多系统的启动、放大与调控。虽然已有许多新药上市,可以调节免疫功能、阻断脂质过氧化、恢复凝血/纤溶平衡等,但是其临床效果欠佳。而且,脓毒性休克是一种临床急症。心血管系统是重要的循环系统,心血管功能异常在脓毒症早期即已存在,尤其在严重脓毒症和脓毒症休克患者中较为显著,有较大比例患者存在左室收缩/舒张功能异常。临床研究证明心脏功能抑制显著增加脓毒血症病人的死亡率。脓毒性心功能障碍已经广泛被关注,但其潜在的机制没有很好的解释。白三烯B4(LTB4)是一种强有力的炎性介质和趋化因子,通过与其相应受体结合而发挥生物学效应,其潜在的炎性脂调节可被涉及在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征、类风湿关节炎和缺血性心脏病等多种疾病的病理生理过程。另外,LTB4通过白三烯B4受体1(BLT1)介导白细胞聚集从而在脓毒症中发挥重要的作用。目前国外已有研究表明LTB4/BLT1通路参与天然免疫和获得性免疫系统免疫细胞功能的调控。LTB4介导的炎症已经证明在1型糖尿病患者中发生脓毒症的敏感性提高。研究发现在脓毒症中血清LTB4浓度提高促进血管内皮功能紊乱,脓毒症中血清LTB4浓度提高,使用BLT1受体拮抗剂后可使脓毒症诱导的各种器官损伤程度减轻,表明LTB4和BLT1对脂多糖诱导的急性心功能障碍可能起作用。腺苷5-单磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是丝、苏氨酸蛋白激酶,主要协调能量和代谢的需要,是细胞能量稳态的重要调节因子。AMPK存在于细胞核和细胞质中允许快速变化(细胞质中蛋白质的磷酸化)和代谢过程的逐渐调整(基因转录的变化)以维持能量的稳态,可启动分解代谢途径,增加ATP的产生,同时关闭合成代谢途径,减少ATP的消耗。研究发现AMPK信号通路与脂多糖诱导的急性心功能障碍有关。值得注意的是,AMPK与能量代谢相关疾病如2型糖尿病、肥胖症、癌症、脑缺血损害、心脏缺血再灌注等相关。研究发现,AMPK信号通路在心脏面临缺血性损伤对能量需求增加时具有重要作用,活化的AMPK有助于增加葡萄糖摄取和糖酵解,加速脂肪酸氧化,增加心肌组织的能量供应,并可以抑制心肌细胞凋亡保护心肌组织,而且对血管平滑肌细胞、内皮细胞的增殖及能量代谢均有影响,在心血管重构过程中起重要作用。然而AMPK和BLT1两者在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系尚不清楚。综上所述,我们提出:抑制LTB4/BLT1受体可能通过激活AMPK信号通路发挥抗脓毒性心功能障碍的作用,并最终通过减轻线粒体功能障碍和抗凋亡途径发挥心肌保护作用。本课题将采用一系列研究模型和实验方法,阐明AMPK和BLT1在脂多糖致脓毒性心功能障碍中的关系及具体作用机制。本研究中,我们探究LTB4/BLT1在脂多糖诱导的小鼠急性心肌损伤模型中的作用和阐明其潜在的机制。通过研究其作用机制和了解治疗靶点才能更好的用于指导临床,进一步改善脓毒症患者的病死率。第一部分:建立LPS诱导的脓毒性心功能障碍小鼠模型,研究抑制LTB4/BLT1受体后对脓毒性心功能障碍的影响目的:建立脓毒性心功能障碍小鼠模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响及抑制LTB4/BLT1受体后对小鼠心功能的影响,明确抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心功能的作用。方法:C57小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立脓毒症模型,观察LTB4对脓毒症小鼠心功能的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)LTB4;(4)LTB4+LPS;(5)U753021μM+LTB4。观察不同浓度LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠的影响。实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LTB4(10mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,小鼠麻醉接受超声心动图检测。记录超声心动图指标,包括:左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF%)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,FS%),和舒张早期到晚期二尖瓣充盈峰值流速比(the peak velocity ratios of early to late mitral inflow filling,E/A ratio)。结果:1)LTB4是否对脓毒症小鼠心功能造成影响。超声心动图分析表明,LTB4组FS%和EF%显著减低(与Control组相比,P<0.01);LPS+LTB4组FS%和EF%显著减低(与LPS组相比,P<0.05);U75302+LTB4组中小鼠的EF轻度减低(与Control组相比,P>0.05)。表明LTB4可导致脓毒症小鼠心功能的损伤。2)不同浓度LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠的心功能是否有保护作用。超声心动图分析表明,LPS处理组可导致FS%和LVEF%有意义的减低,E/A比显著增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302预处理组逆转了FS%和LVEF%的减低和E/A比增加,还呈浓度依赖性(与LPS组相比,P<0.05)。结果表明不同浓度U75302(0.25,0.5,1μM)对脓毒症小鼠的心功能均有明确的保护作用。结论:(1)LPS可以诱导脓毒症小鼠心功能损伤,LTB4可加剧脓毒症小鼠心功能损伤;(2)LBT4/BLT1抑制剂U75302可能有保护脓毒症小鼠心功能损伤的作用。第二部分:研究抑制LTB4/BLT1受体对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能、生存率的影响及可能的作用机制目的:观察LTB4/BLT1受体抑制剂U75302对脓毒症小鼠心肌炎症、凋亡、线粒体功能的各项指标、小鼠生存率的影响及可能的作用机制。方法:实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U75302 0.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,测血浆LTB4的水平。BLT1另一种抑制剂CP105,696也用于评估其对脓毒性心功能障碍心肌炎症、凋亡和线粒体功能的影响。1)通过Real-time PCR法检测TNF-α和IL-6m RNA水平,Western blot法检测p NF-k B和Ik B-α蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌炎症的影响;2)通过Westernblot法检测BCL-2、BAX和cleaved caspase-3的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌凋亡的影响;3)分离提取心肌细胞线粒体,评估complex I(Nd)and complex IV(Co)亚单位密码m RNA表达通过通过Real-time PCR法检测核DNA(Cox4i and Cox5a)or mt DNA(mt-Nd1,mt-Nd2,mt-Co1,and mt-Co2),Western blot法检测ComplexⅠ、ComplexⅡ和OPA1蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对脓毒性心功能障碍小鼠心肌线粒体生物学和功能学的影响;4)通过Westernblot法检测p AMPK、AMPK、p ACC、ACC和PGC1α的蛋白表达来评估不同浓度BLT1抑制剂U75302对保护脓毒症小鼠心功能障碍可能的作用通路;5)基于之前的研究,我们选择U75302 1mg/kg作为最佳浓度。实验分为3组:(1)PBS;(2)LPS;(3)LPS+U75302,LPS(30mg/kg),LPS(30mg/kg)+U75302(1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(1mg/kg),LPS注射前1h进行。LPS注射6h后,观察6h到3d内小鼠生存率并绘制Kaplan-Meier生存曲线。结果:1)LPS预处理后显著增加TNF-α和IL-6m RNA水平及p NF-k B表达(与Control组相比,P<0.05),但是Ik B-α表达减少(与Control组相比,P<0.05),然而U75302可以显著降低TNF-α,IL-6和p NF-κB表达水平及增加Ik B-α表达(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以逆转p NF-k B增加和Ik B-α减少(与LPS组相比,P<0.05)。2)LPS预处理可导致心肌凋亡,相关凋亡蛋白Bcl-2表达减少,Bax和cleavedcaspase-3表达增加(与Control组相比,P<0.05)。然而U75302可以降低凋亡呈浓度依赖的方式(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696可以减少凋亡,Bax表达减少,Bcl-2表达增加。(与LPS组相比,P<0.05)。3)LPS预处理可致complexⅠ,complexⅡ和OPA1表达减少(与Control组相比,P<0.05),核DNA和mt DNA缺失(P<0.05);U75302可以减弱这些改变和保持complex I,complex II and OPA1表达(P<0.05);U75302轻度的逆转m RNA在线粒体的改变(与LPS组相比,P<0.05)。BLT1另一种抑制剂CP105,696通过保持complex I,complex II and OPA1表达可以减轻线粒体损伤。4)LPS预处理后可致p AMPK,p ACC和PGC1α显著增加(与Control组相比,P<0.05)。U75302抑制BLT1受体后导致p AMPK,p ACC和PGC1α表达的增加(与LPS组相比,P<0.05),这表明AMPK信号传导途径的进一步被活化。5)Kaplan-Meier生存曲线结果显示,LPS+U75302组小鼠在LPS注射后72h死亡率显著减低(与LPS组相比,P<0.01)。结论:抑制LTB4/BLT1受体,可以保护脓毒症小鼠心肌细胞炎症、凋亡及线粒体损伤且该保护可能是通过AMPK信号通路介导,从而明确LTB4/BLT1抑制剂U75302对脓毒症小鼠心功能损伤的保护作用。第三部分:研究AMPK信号通路是否参与BLT1抑制剂对毒性心功能障碍的保护作用并探讨其作用机制目的:进一步探讨AMPK信号通路在LPS诱导的小鼠脓毒性心功能障碍过程中可能的作用并阐明其作用机制。方法:1)实验分为5组:(1)Control;(2)LPS;(3)U75302 0.25μM+LPS;(4)U753020.5μM+LPS;(5)U75302 1μM+LPS。 LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(0.25,0.5,1mg/kg),腹腔注射,对照组给予PBS。U75302(0.25,0.5,1mg/kg),LPS注射前1h进行,腹腔注射。通过Western blot方法检测p AMPK/AMPK,p ACC/ACC,PGC1α表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍是否有影响。2)实验分为4组:(1)LPS;(2)LPS+Compound C;(3)LPS+U75302;(4)LPS+U75302 + Compound C。LPS(6mg/kg),LPS(6mg/kg)+Compound C(20mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(1mg/kg),LPS(6mg/kg)+U75302(1mg/kg)+ CompoundC(20mg/kg),腹腔注射。U75302(1mg/kg),LPS注射前1h进行。Compound C(20mg/kg),LPS注射前30min进行。1 LPS注射6h后,小鼠麻醉接受超声心动图检测。观察AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍作用的影响。记录超声心动图指标,包括:左室射血分数(left ventricular ejection fractions,LVEF%)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,FS%),和舒张早期到晚期二尖瓣充盈峰值流速比(the peak velocity ratios of early to late mitral inflow filling,E/A ratio)。2 Real-time PCR法检测TNF-α和IL-6m RNA水平,Western blot法检测p NF-k B和Ik B-α蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌炎症的影响。3 Western blot法检测BCL-2、BAX和cleaved caspase-3的蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌凋亡的影响。4分离提取心肌细胞线粒体。Real-time PCR法检测Cox4i、Cox5am RNA和mt-Nd1、mt-Nd2、mt-Co1、mt-Co2m RNA水平,Western blot法检测ComplexⅠ、ComplexⅡ和OPA1蛋白表达来评估AMPK通路阻断剂Compound C对U75302抗脓毒性心功能障碍心肌线粒体生物学和功能学的影响。结果:1)U75302处理能显著提高p AMPK/AMPK、p ACC/ACC和PGC1α蛋白的表达(与control或LPS组相比,P<0.05)。2)Compound C没有导致FS%,E/A比或LVEF%改善(与LPS组相比,P>0.05)。然而,Compound C可以显著地降低FS%和LVEF%,增加E/A比(与LPS+U75302组相比,P<0.05)。3)Compound C处理后TNF-α、IL-6 m RNA、p NF-κB和IκB-α蛋白表达水平轻度改变(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C通过上调TNF-α、IL-6 m RNA和p NF-κB蛋白表达水平,下调IκB-α蛋白表达水平逆转了U75302的抗炎症作用(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。4)Compound C显著地抑制AMPK和ACC磷酸化,轻度的下调PGC1α表达(与LPS组比较,P<0.05)。而且,Compound C逆转了通过U75302处理后PGC1α、AMPK和ACC磷酸化的上调表达(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。5)Compound C处理没有影响凋亡依赖蛋白的表达(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C逆转U75302处理后Bcl-2的增加和Bax及cleaved caspase-3的减少(与LPS+U75302组比较,P<0.05)。6)Compound C处理没有影响complex I,complex II and OPA1表达(与LPS组比较,P>0.05)。然而,Compound C处理下调complex I,complex II and OPA1表达(与LPS+U75302组相比,P<0.05)。mt-Nd1,mt-Nd2,mt-Co1,mt-Co2,Cox4i and Cox5a m RNA水平与Western blot检测结果显示呈一个持续的趋势。结论:抑制LTB4/BLT1受体减轻心肌细胞炎症及凋亡,其可能通过激活AMPK信号通路,抑制NF-κB信号传导和线粒体损伤来介导发挥抗脓毒性心功能障碍的保护作用。