癌症是威胁人类生命健康的最重大的疾病之一,在各类疾病中,癌症的死亡率仅次于心脑血管疾病,居于第二位。化疗作为清除癌细胞的主要手段之一对于抗癌有很大作用,但因其本身有很大的毒副作用,对于正常细胞和癌细胞的区分度低,还容易致使瘤细胞产生耐药性,使其临床应用存在很大局限性。因此寻找针对肿瘤细胞特异性强,杀伤力强,而对正常细胞毒性低的新型抗癌资源成为研究热点。抗菌肽是一种广泛存在于自然界的阳离子多肽,具有广谱生物学活性。抗菌肽除了具备抗细菌作用外,还具有抗病毒、真菌、原虫和恶性肿瘤作用。到目前为止已分离鉴定约185种对肿瘤细胞具有杀伤作用的抗菌肽,使得抗菌肽成为新一类的抗癌资源。然而天然的抗菌肽受到抗癌活性和选择性的限制使得抗菌肽无法直接作为抗癌药物。抗菌肽CM4是一个由36个氨基酸组成的阳离子抗菌肽,具有一定的抗癌活性,但是抗癌活性不高,抗菌谱窄。抗菌肽CM4的高度选择性使其成为一种有潜力的抗癌药物。提高抗菌肽CM4的抗癌活性而不改变其选择性已经成为迫切需要研究的课题。脂肪酸修饰是蛋白质修饰的重要类型,在介导蛋白质-蛋白质、蛋白质-生物膜的相互作用中发挥着重要作用。因此本研究使用丁酸、己酸、辛酸、葵酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸对抗菌肽CM4进行修饰,探究脂酰化修饰抗菌肽的抗癌活性规律以及作用机理,以期为临床应用提供理论依据。1、对抗菌肽CM4进行脂酰化修饰,化学合成得到丁酰化CM4(But-CM4)、己酰化 CM4(Cap-CM4)、辛酰化 CM4(Oct-CM4)、葵酰化 CM4(Dec-CM4)、月桂酰化CM4(Lau-CM4)、豆蔻酰化CM4(Myr-CM4)、棕榈酰化CM4(Pal-CM4)。2、通过MTT实验检测抗菌肽CM4、丁酰化CM4(But-CM4)、己酰化CM4(Cap-CM4)、辛酰化 CM4(Oct-CM4)、葵酰化 CM4(Dec-CM4)、月桂酰化 CM4(Lau-CM4)、豆蔻酰化 CM4(Myr-CM4)、棕榈酰化 CM4(Pal-CM4)对乳腺癌细胞(MCF-7、MX-1)、前列腺癌细胞(PC-3、DU-145)、淋巴癌细胞(Raji、Daudi)、肺癌细胞(A549)等七种肿瘤细胞的杀伤活性,结果表明从C4到C16脂酰化修饰都能极显著提高CM4对多种肿瘤细胞的杀伤活性,并且随着碳链增长,抗癌活性越强,与未修饰的CM4相比,IC50(半抑制浓度)降低了 25-35倍,约为3-6μM。3、通过MTT实验检测抗菌肽丁酰化CM4(But-CM4)、己酰化CM4(Cap-CM4)、辛酰化 CM4(Oct-CM4)、葵酰化 CM4(Dec-CM4)、月桂酰化 CM4(Lau-CM4)、豆蔻酰化 CM4(Myr-CM4)、棕榈酰化 CM4(Pal-CM4)对三种正常细胞小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)、人正常肝细胞(L02)、人正常前列腺基质永生化细胞(wpmy-1)的毒性,结果表明脂酰化CM4同时也增强了对正常细胞的毒性,在浓度达到40μM时,三种正常细胞的存活率仍达到75%以上,远远小于对癌细胞的毒性,表现出明显的选择性。通过溶血性实验。结果表明脂酰化修饰的抗菌肽CM4的溶血性增加,且脂酰基链越长,溶血性越明显。但在IC50不出现溶血。CD光谱分析脂酰基修饰对CM4二级结构的影响,结果表明几种脂酰基都能提高CM4的α-螺旋结构含量,脂肪酸链越长,α-螺旋结构含量增加越明显,脂肪酸链没有改变CM4的二级结构种类。因此,脂肪酸能够显著提高抗菌肽CM4对肿瘤细胞的杀伤活性,且不改变CM4的选择性。4、荧光标记流式结合细胞分析表明,几种脂肪酸修饰的CM4显著增强与乳癌MCF-7细胞的结合能力,同时也增强了对正常细胞NIH3T3的结合能力,但是对乳腺癌细胞的结合能力大于对正常细胞的结合能力。激光共聚焦观察脂酰化CM4与MCF-7细胞和NIH3T3细胞的结合,结果表明丁酰化和辛酰化增强了CM4与MCF-7的膜结合能力,月桂酰化和棕榈酰化介导了 CM4的跨膜转运,并且脂肪酸链越长,跨膜转运越明显。对月桂酰CM4电荷突变发现,正电荷在介导抗菌肽与MCF-7结合过程中发挥重要作用。5、LDH释放实验结果表明在低浓度下脂酰化CM4对MCF-7的细胞膜破坏不明显,高浓度下脂酰化CM4对MCF-7的细胞膜破坏能力明显增强,具有时间和脂酰基链长的依赖性。DAPI染色和AnnexinV/PI双染实验表明几种脂酰化修饰的CM4可以诱导MCF-7凋亡,随着浓度的增加和脂酰基链长的增加,凋亡率升高。PI单染表明脂酰化CM4诱导MCF-7细胞发生周期阻滞,主要阻滞在S期,可见脂酰化CM4也影响MCF-7细胞周期。6、ROS检测结果表明脂酰化CM4可以引起MCF-7细胞ROS的升高,脂酰化CM4也能破坏线粒体的功能,并引起线粒体膜电位的降低。Westernblot表明脂酰化CM4诱导凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-9发生切割,bax表达上升,bcl-2表达下降,周期相关蛋白CyclinA表达下降,CyclinD1无明显变化,CyclinE1表达升高。表明脂酰化CM4可以通过线粒体依赖途径诱导乳腺癌细胞凋亡。综上所述,本研究开展了不同链长脂酰基修饰对CM4抗癌活性的影响及分子机制的初步研究,表明脂酰基修饰能显著增强CM4的抗癌活性,并且随链长增加,抗癌活性越强。不同脂酰化修饰CM4同时也增强了正常细胞的毒性和溶血活性,但是在相同作用浓度下,对肿瘤细胞作用强于对正常细胞。脂酰基促进了抗菌肽CM4与细胞表面的结合能力及跨膜转运能能力,可以通过改变线粒体功能,诱导活性氧产生,诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,也可以影响细胞周期。本研究认为脂酰化修饰对提高抗菌肽抗癌活性是一种有效的手段。本研究结果对于设计高抗癌活性、低毒副作用的脂酰化修饰抗菌肽具有重要的理论价值。