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实验目的1.在实验研究过程中我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin)基因进行生物信息学的分析；并应用分子生物学方法从家蝇幼虫体内提取抗菌肽防御素(defensin)基因，并对该基因进行克隆、表达与纯化。2.鉴定已纯化的家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)部分对大肠杆菌E.coliK12D31的抑制作用；观察抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肿瘤细胞HepG2,SIHA,SW480和对人正常心肌细胞H9C2的抑制及杀伤作用；比较该防御素成熟肽(MD)与羟基脲分别对肝癌细胞HepG2的作用效果。3.观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响；观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响；观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响，从而探究抗菌肽防御素成熟肽(MD)杀伤肝癌细胞HepG2的作用机制与原理。实验方法我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin)基因的主要特性进行生物信息学的分析。应用蛋白质分析专家系统（ExPASy）上的SOSUI、 ProtParam、HNN、TMHMM、MotifScan和NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析软件进行分析，并结合DNAman、Gene Runner等生物信息学分析软件进行分析、预测家蝇抗菌肽防御素defensin蛋白的可溶性及理化性质、翻译后修饰位点、跨膜区、亲（疏）水性、二级结构、三级结构及同源性分析，以及遗传关系的比对等。在Genbank中检索家蝇defensin基因，根据其设计特异性引物，我们在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR聚合酶链反应扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin, MD)，并将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行质粒重组，构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经25℃IPTG诱导在大肠杆菌E.Coli DH5ɑ中表达，用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白，表达产物经15%SDS-PAGE分析鉴定。应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法求出不同浓度抗菌肽MD对SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞的抑制率及对人心肌细胞H9C2的抑制作用。用MTT法对不同浓度抗菌肽防御素作肿瘤细胞的生长曲线。采用MTT比色法分别求出不同浓度抗菌肽防御素与羟基脲对肝癌细胞HepG2的抑制率，依据药物浓度和抑制率用SPSS软件求出防御素和羟基脲的半数抑制率(median inhibitory concentration，IC50)和回归方程。我们采用AnnexinV-Fitc-PI双染凋亡检测试剂盒检测抗菌肽防御素MD，检测它能否引起肝癌细胞HepG2的细胞凋亡。我们用流式细胞仪检测抗菌肽防御素MD，观察它对肝癌细胞HepG2细胞周期及凋亡的影响。本实验室应用caspase-3检测试剂盒与酶标测定仪检测该蛋白caspase-3酶的活性。实验结果我们通过生物信息学分析defensin蛋白由92个氨基酸组成，该蛋白的分子式为C435H670N126O124S9,它的分子质量单位为9.9374ku，计算它的等电点理论值为8.75，检测波长280nm时的吸光度（A）值为0.637，半衰期为30h，该蛋白具有4个翻译后修饰位点。家蝇防御素与其他三种蝇科昆虫防御素同源性较近。以家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽MD的cDNA为摸板进行扩增后获得的碱基长度为142bp的defensin基因片段，本实验成功构建重组质粒pGEX-6P-1/MD;之后菌液通过IPTG诱导后进行SDS-PAGE胶进行分析，实验结果显示了在大肠杆菌BL21（DE3）中防御素成熟肽MD基因片段高效表达，它的相对分子量（Mr）约30kDa。本实验抑菌实验结果显示家蝇幼虫抗菌肽防御素对大肠杆菌E. coli K12D31有抑杀作用；我们用MTT法检测显示六种不同浓度（30μg/ml,60μg/ml,120μg/ml,360μg/ml,680μg/ml,1000μg/ml）抗菌肽防御素MD对SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，实验结果与正常对照组比较结果具有统计学意义(p<0.05)；这六种不同浓度抗菌肽防御素对人心肌细胞H9C2均无较明显抑制作用，其实验结果与正常对照组相比较无统计学意义(p>0.05)；三种肿瘤细胞SW480，SIHA，HepG2在不同浓度抗菌肽防御素MD作用下生长受到明显抑制，防御素浓度和作用时间对细胞的抑制作用呈剂量反应关系；经计算防御素与羟基脲的回归方程分别为=-1.566+0.529x和=-2.342+0.597x，它们的IC50半数抑制率分别是909μg/ml和8416μg/ml，结果显示两者的IC50相差较大，那么表明防御素的细胞增殖抑制作用比羟基脲高。用流式细胞仪检测抗菌肽防御素MD对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响结果：结果显示GI期与M期的细胞比例有所增加，而S期细胞比例反而下降。显示结果中只有GI期和S期与PBS对照组相比具有统计学意义(p<0.01)，说明抗菌肽防御素MD使HepG2细胞周期在GI期停滞致使S期DNA的合成受到抑制。SW480，SIHA，HepG2这几种肿瘤细胞之间的增殖抑制率在不同浓度组抗菌肽防御素MD作用下均无统计学意义(p>0.05)。抗菌肽防御素MD对HepG2细胞caspase-3含量的影响结果：防御素组caspase-3的含量高于PBS对照组，两者比较差异具有统计学意义。结论通过生物信息学发现家蝇幼虫抗菌肽防御素defensin基因具有其特定的结构，可能具有抗菌活性及其他生物学活性；家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达，证明这三种肿瘤细胞SW480，SIHA，HepG2都能被纯化蛋白MD抑制杀伤，这为以后研发家蝇抗菌肽防御素类药物提供了依据。抗菌肽防御素MD能够抑制大肠杆菌生长繁殖活性；SW480，SIHA，HepG2三种肿瘤细胞均能被抗菌肽MD所抑制，但正常人体心肌细胞H9C2不能被其抑制；抗菌肽防御素比羟基脲对HepG2细胞具有更好的增殖抑制作用；SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞的抑制作用与抗菌肽MD呈剂量效应关系；将传统抗肿瘤药物与家蝇抗菌肽防御素MD比较，家蝇抗菌肽MD既能有效杀伤肿瘤细胞，又不损伤正常人体心肌细胞H9C2；家蝇抗菌肽MD可能通过两种途径发挥抑制肿瘤作用：肝癌细胞HepG2细胞周期受到抑制S期DNA的合成的影响；经线粒体途径诱导肝癌细胞HepG2细胞凋亡。