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传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)是虹彩病毒科(iridoviridae)肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)的代表种,是养殖鳜暴发流行病的主要病原,近年来给鳜养殖业造成严重的经济损失。本论文通过ISKNV对经济养殖鱼类鳜(Siniperca chuatsi)(高死亡率宿主)和两种鱼类模式生物斑马鱼(Danio rerio)(敏感宿主)、黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)(非致死宿主)的感染,从死亡率、临床症状、组织病理分析和免疫荧光分析四个角度对比分析了ISKNV对三种类宿主的感染特性。
本文根据ISKNV的全基因组序列设计筛选了ISKNV全基因组的124个ORF的荧光定量引物对。通过荧光定量PCR技术,利用这些引物检测了ISKNV病毒在鳜细胞MFF-1中不同感染时间段病毒基因的转录情况,并对表达情况进行了层次聚类(Hierarchical Clustering)分析。通过放线菌酮和阿菲迪霉素的药物抑制试验,确定了ISKNV的极早期、滞早期和晚期基因。还进一步研究了ISKNV在三种不同类型鱼类宿主活体内(脾脏)的表达谱。通过对ISKNV在鳜体外(鳜细胞)与体内(鳜脾脏)表达谱、对ISKNV在鳜、斑马鱼与黑青斑河鲀三种宿主体内的表达谱进行比较和分析,并发现这些表达谱之间存在着的差异,这些将有助于阐明病毒基因的功能。为研究病毒与宿主的相互作用,通过荧光定量PCR技术,对ISKNV的三种不同致死性宿主代表鳜、斑马鱼和黑青斑河鲀的212个免疫基因(其中鳜16个、斑马鱼122个和黑青斑河鲀74个)在ISKNV感染过程中转录水平变化进行定量分析,发现其中71个免疫基因被明显上调,其中33个基因的转录是首次被发现在病毒感染过程中有显著性上调。并发现三种鱼类宿主在Ⅰ-型和Ⅱ-型干扰素信号传导通路上的基因转录变化较大。
对黑青斑河鲀在ISKNV感染过程中的应激基因Ⅰ-型干扰素基因Tn-IFNΦ和黑青斑河鲀CRFb基因家族的3个应激基因Tn-CRFb2、Tn-CRFb3和Tn-CRFb4进行了研究。对Tn-CRFb2、Tn-CRFb3和Tn-CRFb4进行了在11个组织中进行组织分布研究,发现这3个基因在脾脏中都有最高的表达,在肌肉中都检测不到。果蝇细胞表达纯化的Tn-IFNΦ蛋白对ISKNV在鳜细胞中的增殖有剂量依赖性的抑制作用。Tn-IFNΦ蛋白在黑青斑河鲀活体内能上调部分脾脏免疫基因的转录。免疫共沉淀实验表明Tn-IFNΦ与Tn-CRFb4相互作用。这表明Tn-CRFb4很可能是黑青斑河鲀中Ⅰ-型干扰素受体(含有两个亚基)中的一个亚基。这是首次发现Tn-IFNΦ能与Tn-CRFb4相互作用。