论文部分内容阅读
研究目的缺血性脑卒中具有较高的致残率和致死率,给社会和家庭带来了沉重的负担。由于治疗或者机体自身的代偿机制导致缺血区域血流的再灌注,可造成再灌注区域组织器官的进一步损伤,即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI）。T淋巴细胞介导的炎症反应是导致CIRI的重要原因,IL-33/ST2轴与T淋巴细胞免疫应答关系密切。目前缺血性脑卒中临床治疗策略有限,针刺治疗缺血性脑卒中在近年来取得了较好的临床疗效,而外泌体已被证实能够抑制炎症反应减轻CIRI,从而发挥神经保护作用。本论文着重探讨电针百会、足三里联合诱导多能干细胞分泌的外泌体（induced pluripotent stem cells derived extracellular vesicles,iPSC-EVs）对脑缺血再灌注损伤小鼠的保护作用及其炎症机制,为缺血性脑卒中的临床治疗提供新的研究思路和实验依据。实验方法采用健康的雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄）,按照随机数字表法随机分为6组:假手术（Sham）组、模型（MCAO）组、假针刺（Sham Acu）组、电针百会、足三里（EA）组、外泌体（iPSC-EVs）组和电针百会、足三里联合外泌体（EA+iPSC-EVs）组,每组小鼠10只,采用小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）制备MCAO模型,本实验分多批次进行,实验共用小鼠64只,死亡4只。Sham组仅分离右侧颈总、颈内和颈外动脉,不插入线栓;MCAO组以线栓法阻塞小鼠右侧大脑中动脉1h,再灌注72h,制备MCAO模型;Sham Acu组在造模成功后,在非经非穴点（左侧髂前上棘上方10mm处）进行针刺,不接脉冲治疗仪,每次30min,每日1次,共3次;EA组在造模成功后取小鼠百会和左侧足三里,连接脉冲治疗仪,连续波,频率2Hz,强度1mA,每次30min,每日1次,共3次;iPSC-EVs组在造模成功后随即在小鼠尾静脉注射iPSC-EVs,20μg/只,每日1次,共3次;EA+iPSC-EVs组在造模成功后分别进行电针干预和尾静脉注射iPSC-EVs,每日1次,共3次。假手术组和模型组小鼠仅每日抓取刺激一次,不做任何干预。采用纳米流式检测iPSC-EVs的粒径大小、粒子浓度以及表面标记物,用透射电镜观察外泌体形态。每组10只小鼠都进行Clark神经功能评分、圆筒试验和旷场试验评估神经行为功能;随后10只小鼠都采用流式细胞术检测外周T淋巴细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Treg）数量的变化;然后取5只小鼠通过TTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色评价脑梗死体积;剩余5只小鼠采用TUNEL染色评价脑缺血区神经元凋亡情况,同时进行免疫荧光染色、Western Blot检测大脑IL-33/ST2轴蛋白的表达以及星形胶质细胞和小胶质细胞的变化。验证电针百会、足三里联合iPSC-EVs通过干预IL-33/ST2轴,调节T淋巴细胞免疫应答,从而减轻脑缺血再灌注炎症损伤的科学假说,为治疗脑缺血再灌注损伤提供新的研究思路和实验依据。实验结果1.电针百会、足三里联合iPSC-EVs对MCAO小鼠神经功能的影响Clark神经功能评分从身体对称性、步态、攀爬、转圈试验、前肢对称性、强迫转圈和胡须反应性七个方面评估小鼠神经功能损伤情况。分数越高,损伤越大。结果显示,与假手术组相比,模型组小鼠神经功能评分显著升高（P＜0.001）,而电针组、iPSC-EVs组以及两者联合干预组与模型组比较可显著降低Clark评分（P＜0.001）,三个干预组之间无显著差异（P＞0.05）,电针组与假针刺组比较有显著的差异（P＜0.001）。圆筒试验结果显示,电针组、iPSC-EVs组及两者联合干预在小鼠脑缺血再灌注72h对神经功能都有不同程度的改善（电针组P＜0.05,iPSC-EVs 组P＜0.001,EA+iPSC-EVs 组P＜0.001）,电针组与假针刺组比较有显著的差异（P＜0.05）。旷场结果显示,电针组和iPSC-EVs组均能改善MCAO小鼠的运动功能障碍（P＜0.05和P＜0.01）,但两者联合干预的改善作用更为明显（P＜0.001）。假针刺组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）。2.电针百会、足三里联合iPSC-EVs对MCAO小鼠脑梗死体积和神经元凋亡的影响TTC染色结果显示,MCAO小鼠在脑缺血再灌注72h可见明显的白色脑梗死区。电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs干预后,MCAO小鼠在皮层、纹状体和整个半球的脑梗死体积都明显减小（P＜0.001）,联合干预组效果显著优于电针组和iPSC-EVs组（P＜0.001）。TUNEL染色结果显示,在脑缺血再灌注过程中,MCAO小鼠大脑缺血区域存在显著的神经元凋亡,电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs以及两者联合干预都可有效减轻神经元凋亡（P＜0.001）,两者联合干预的效果显著优于电针组和iPSC-EVs组（P＜0.001）。假针刺组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）,电针组与假针刺组比较有显著的差异（P＜0.001）。3.电针百会、足三里联合iPSC-EVs对MCAO小鼠T淋巴细胞增殖分化的影响流式细胞术结果显示,在脑缺血再灌注72h,模型组小鼠中Th1（IFN-γ+Th）和Th17（IL-17+Th）细胞数量均显著升高（P＜0.001）,电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs干预能够显著抑制这种异常升高（P＜0.01）,尤其是在两者联合干预后,这种抑制作用更为明显（P＜0.001）。电针组与假针刺组比较有显著差异（P＜0.05）。相反,电针百会、足三里联合iPSC-EVs能够显著提高MCAO小鼠中Treg（Foxp3+Treg）细胞的数量（P＜0.01）,抑制炎症反应,联合干预的效果显著优于电针组和iPSC-EVs组（P＜0.05）。而Th2（IL-4+Th）细胞的数量在各组间无统计学差异（P＞0.05）。4.电针百会、足三里联合iPSC-EVs对MCAO小鼠IL-33/ST2轴相关蛋白表达的影响免疫荧光和Western Blot结果显示,脑缺血再灌注72h后,模型组小鼠大脑缺血区域IL-33阳性细胞数量和蛋白表达水平明显升高（P＜0.001和P＜0.01）,电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs以及两者联合干预都能有效下调这一趋势（P＜0.001和P＜0.01）。与电针组和iPSC-EVs组比较,电针联合iPSC-EVs组能够更显著地抑制IL-33的表达（P＜0.001）。与此同时,脑缺血再灌注引起IL-33升高的同时伴随着大脑内星形胶质细胞的激活,免疫荧光结果显示,模型组小鼠脑梗死区GFAP 阳性细胞数量明显增高（P＜0.001）,而电针百会、足三里和iPSC-EVs 的干预均能显著降低 GFAP 阳性细胞的数量（P＜0.05）,这一效果在两者联合干预组中更为明显（P＜0.001）。除此之外,通过免疫荧光共定位发现,IL-33主要表达在星形胶质细胞内。同样,MCAO小鼠大脑缺血区ST2的表达趋势与IL-33相似,上调的ST2水平能够被电针百会、足三里和iPSC-EVs显著逆转,尤其是在联合干预组这种效果更明显（P＜0.001）。假针刺组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）,电针组与假针刺组比较有显著的差异（P＜0.001）。5.电针百会、足三里联合iPSC-EVs对MCAO小鼠小胶质细胞活化的影响在脑缺血再灌注过程中,脑梗死区的小胶质细胞迅速激活和增殖,激活的小胶质细胞在形态上逐渐变大变圆,分支逐渐减少。免疫荧光结果显示,在脑缺血再灌注72h后,模型组小鼠大脑梗死区总体的小胶质细胞数量和活化状态的小胶质细胞比例均有明显上调（P＜0.001）,同时静息状态的小胶质细胞比例则明显下降（P＜0.001）。电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs以及两者联合干预都能显著逆转上述指标,但与电针组和iPSC-EVs组相比较,电针百会、足三里联合iPSC-EVs 组的改善作用更为显著（P＜0.001）。假针刺组与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）,电针组与假针刺组比较有显著的差异（P＜0.001）。结论1.脑缺血再灌注损伤72h,电针百会、足三里、尾静脉注射iPSC-EVs及两者联合干预都能改善脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能评分,减轻神经功能障碍,减小脑梗死体积,改善神经元凋亡,减轻脑损伤。电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs对脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用相当,两者联合干预的作用优于单独电针百会、足三里和单独iPSC-EVs干预。假针刺无脑保护作用。2.脑缺血再灌注损伤72h,电针百会、足三里、尾静脉注射iPSC-EVs及两者联合干预对脑缺血再灌注损伤小鼠Th2细胞无明显调节作用,但可以显著下调Th1和Th17细胞数量,三个干预组作用相当,电针百会、足三里和假针刺比较有显著差异;两者联合干预能够显著上调Treg细胞的数量,减轻炎症反应,效果优于单独电针百会、足三里和单独iPSC-EVs干预。3.脑缺血再灌注损伤72h,电针百会、足三里、尾静脉注射iPSC-EVs及两者联合干预可调节脑缺血再灌注损伤小鼠大脑内IL-33/ST2轴的表达,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,减轻脑缺血再灌注损伤小鼠的炎症反应。电针百会、足三里和iPSC-EVs作用相当,两者联合干预的效果显著优于两者单独干预。创新点1.干预手段创新:本论文在电针百会、足三里干预脑缺血再灌注损伤的基础上,以尾静脉注射iPSC-EVs联合电针百会、足三里作为新的干预手段,并比较了电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs以及两者联合干预的效果差异。同时设立了假针刺组,为今后探讨针刺与外泌体结合在脑卒中治疗中应用的可能性提供了实验依据。2.理论创新:本论文探讨了电针百会、足三里和尾静脉注射iPSC-EVs对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织中IL-33/ST2轴表达以及免疫调节的作用。经文献检索查新未见与本研究相关的报道。