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研究目的:检测水通道蛋白1(Aquaporin1,AQP1)在成年及出生前、后雄性小鼠生殖系统内表达与分布;观察碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺对雄性小鼠生殖道AQP1表达、精子质量及雄性受精能力的影响,为探讨雄性生殖生理过程中水代谢及转运机制提供科学依据和理论基础。
研究方法:利用RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学染色方法,观察(1)成年及(2)胚龄19d(E19)、出生后15d(P15)、35d(P35)和70d(P70)雄性ICR小鼠睾丸、附睾、输精管、腹侧前列腺、精囊腺AQP1mRNA和蛋白的表达水平及其在细胞中的定位;(3)通过口服(灌胃)乙酰唑胺建立动物模型,利用Hansson染色法、Western Blot、免疫组织化学染色方法检测乙酰唑胺对雄性生殖道碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA)活性、AQP1蛋白表达与分布的影响;评估模型动物附睾尾和输精管内精子数量、活动度以及受精能力;利用电子显微镜术、流式细胞术、单细胞凝胶电泳观察精子超微结构改变、精子泛素化程度、精子核DNA完整性。
研究结果:(1)RT-PCR结果显示AQP1 mRNA表达于成年小鼠睾丸、附睾、输精管、腹侧前列腺和精囊腺。Western Blot结果显示小鼠睾丸、输精管、腹侧前列腺存在代表非糖基化AQP1与糖基化AQP1的29kDa和35-45kDa的特异性反应条带;附睾仅存在35-45kDa的糖基化AQP1反应条带;精囊腺仅存在29kDa的非糖基化AQP1反应条带。免疫组织化学染色结果显示AQP1阳性反应物质主要分布于小鼠睾丸网、输精管、腹侧前列腺、精囊腺上皮细胞的细胞膜以及近端、远端输出小管非纤毛细胞的细胞膜。(2)RT-PCR检测结果均显示P70小鼠睾丸、输精管、精囊腺、腹侧前列腺AQP1 mRNA及蛋白表达量较P15均显著增强(p<0.05);而P70附睾AQP1mRNA及蛋白表达量较P15显著降低(p<0.05)。Western Blot结果显示P70小鼠睾丸、输精管、腹侧前列腺、精囊腺29kDa和/或35-45kDa的特异性反应条带强度较P15显著增强(p<0.05);P70小鼠附睾35-45kDa的特异性反应条带强度较P15显著降低(p<0.05)。免疫组织化学染色结果显示AQP1蛋白表达于E19小鼠胚胎附睾头部附睾管上皮细胞游离面细胞膜、输精管上皮细胞游离面细胞膜及间充质细胞。P15、P35时AQP1蛋白仅表达于小鼠近端、远端输出小管上皮细胞细胞膜、腹侧前列腺腺泡上皮细胞基底膜及间质细胞和精囊腺平滑肌细胞,睾丸网、输精管、精囊腺上皮细胞AQP1蛋白呈阴性表达;至P70,AQP1蛋白则强烈表达于睾丸网、输精管、腹侧前列腺和精囊腺上皮细胞和输出小管非纤毛细胞的细胞膜。(3)Hansson染色结果显示乙酰唑胺可抑制小鼠附睾、输精管CA活性;Western Blot和免疫组织化学结果显示乙酰唑胺可下调小鼠睾丸网、附睾(输出小管)、输精管上皮细胞AQP1蛋白的表达;并引起附睾尾和输精管内精子数量、精子活动度、雄性受精能力的显著下降;但精子超微结构、泛素化程度均无明显改变,且精子核DNA完整、无损伤。
结论:(1)AQP1广泛表达于小鼠雄性生殖道和附属性腺上皮细胞的细胞膜,提示AQP1可能在维持生殖系统水平衡、促进精子浓缩、成熟方面发挥重要的生理作用。(2)AQP1 mRNA及蛋白在雄性小鼠睾丸网、附睾、输精管、腹侧前列腺和精囊腺的表达与分布随年龄增长而改变,此变化可能与雄性生殖器官发育成熟及生殖功能完善密切相关。(3)乙酰唑胺可下调小鼠雄性生殖道AQP1表达;我们推测由AQP1表达异常所引起水代谢及转运机制障碍可能与小鼠精子数目、活动度及雄性受精能力降低相关,但不影响精子超微结构和遗传特性。