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根据家畜促黄体素释放激素(LHRH)的氨基酸序列及相应的大肠杆菌偏爱密码子,人工合成了LHRH全基因,克隆到大肠杆菌硫氧还蛋白(TRX)融合表达载体pET-32c中。研究了诱导物IPTG浓度、Amp浓度、诱导时间对TRX-LHRH融合蛋白表达产量的影响,结果表明用IPTG诱导时,诱导后4h表达产量达最高值(33.2%),而IPTG及Amp浓度在一定范围内对表达产量无影响;该载体还可用乳糖为诱导物,1%乳糖即可达到与IPTG相同的效果。同时证明融合蛋白主要以可溶性形式存在,可用渗透休克的方法提纯,而pET-32c载体蛋白则主要以不溶性形式存在,对其改造后使其成为可溶性形式。以上研究为大量生产TRX-LHRH融合蛋白奠定了基础。 建立了戊二醛两步法将LHRH标准品与载体蛋白偶联的方法,分别制备了高效价的兔抗BSA-哺乳型LHRH及BSA-禽型LHRH抗体,并比较了BSA和金黄色葡萄球菌(SAC)两种分子作载体免疫效果的差异,结果表明以BSA作载体免疫效果较好。 应用间接ELISA及其抑制试验鉴定了TRX-LHRH融合蛋白的反应原性,证明该融合蛋白与兔抗哺乳型LHRH抗体反应性良好;用TRX-LHRH融合蛋白免疫二月龄家兔,能刺激其产生特异性的LHRH抗体,免疫两次后家兔睾丸萎缩、生精管出现空泡变性、多核细胞增多、精子产生能力减弱或受阻。说明TRX-LHRH融合蛋白可以用于家畜的免疫去势。 将人工合成的两个哺乳型LHRH(mLHRH)及一个禽型LHRH(aLHRH)串联基因克隆到pET-32c载体中并将mLHRH的第十位氨基酸改为Asn,在大肠杆菌中表达得到了可溶性的TRX-mLHRH-aLHRH-mLHRH融合蛋白,经间接ELISA及其抑制试验和免疫印迹证明该融合蛋白具有aLHRH反应原性,但mLHRH反应原性较弱,可能与第十位氨基酸改变有关。