背景口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的3％～5％，近年来，口腔癌的发生趋向年轻化，年轻人口腔癌的发生率波动范围在0.4％～5.5％之间。口腔癌病变发展至晚期，虽可经过手术治疗、放射治疗和化学治疗等手段，但均会对患者局部组织结构造成破坏，影响颌面部结构和功能，给患者带来极大的身心痛苦。因此，研究口腔癌的发生、发展及预防口腔癌受到广大学者重视。对口腔癌高危人群的普查显得尤为重要。建立与人类口腔相近的大鼠口腔腭粘膜鳞状细胞癌模型，用生物染料染色，肉眼及组织学观察建模全过程的粘膜变化情况，为口腔癌的早期诊断奠定基础。用于建立口腔癌动物模型的动物有叙利亚金黄地鼠、大鼠、小鼠。由于颊囊的特殊解剖和生理环境与人类口腔粘膜差别很大，其研究结果的可靠性受到限制。国内外学者已不再满足于单纯的癌模型建立，而是寻找建立与人类口腔环境相近更具代表性的口腔癌模型。目前，口腔癌的诱癌模型中应用较多的动物是大鼠和小鼠。有学者等将4NQO涂于28只28周龄的Wistar大鼠硬腭后部腭粘膜，每周三次。共19周，诱导出口腔腭粘膜癌。有学者等报道在大鼠口腔硬腭粘膜涂抹4-NQO1，2，4，8，12，16周后饲养至24周，肉眼观察诱癌8周的动物硬腭粘膜有腭皱分界不清等少许变化，而诱癌12周的动物可见明显肿瘤。组织病理学结果显示诱癌8周的动物硬腭粘膜为中或重度异常增生，而诱癌12周的动物都是高分化、角质化的鳞癌。Ribeiro等用0.005％4NQO饮用水喂养Wistar大鼠，第20周时诱导出分化良好的鳞状细胞癌。用生物染料染色，国内外学者已经广泛应用于各种癌前病变和癌症的辅助检查中。Canto等在对43个病人的Barrett’s食管病变的研究报道中指出，美蓝染色后活检比常规随机活检诊断特异的柱状上皮、异常增生和癌的准确率高。Dawsey等研究发现常规内镜检查与12ml／l卢戈液染色的内镜检查相比，卢戈液染色下内镜对癌前病变、早期浸润癌敏感性更高。1960年，Sharwin就首次报道了用甲苯胺蓝(Toluidine Blue)活体染色的方法，观察口腔内及咽喉的可疑病变，鉴别其良恶性。Oratest是一种药用等级的甲苯胺蓝试剂，其应用有所报道，但效果尚不肯定。目前，在动物口腔粘膜诱癌过程中动态研究粘膜变化，并用生物染料进行染色观察，进一步寻找相对可靠的生物染料试剂尚未见报道。目的本实验用化学方法诱导与人类环境相近的大鼠口腔粘膜癌动物模型。再结合生物染料美蓝、卢戈液进行无创性辅助诊断，比较二者对诱癌过程的粘膜敏感性，选择一种更适合的生物染料，为口腔癌的早期诊断提供辅助诊断手段。方法1．建立动物模型：所有动物按照随意数字表分成两组。实验组54只Wistar大鼠，每笼6只。实验组用消毒棉签蘸0.5％4NQO二甲基亚砜液0.05ml～0.1ml涂擦Wistar大鼠腭部，每周3次，连续涂擦24周。对照组6只，不施加任何处理，常规饮水饮食。在实验开始后第10、13、16、19、21、24周按照随机数字表从实验组选择8只，从对照组选择1只处死。2．在建模过程中，从第10周开始进行实验组和对照组大鼠染色观察。实验前按照随机数字表随机抽取8只实验组大鼠和1只对照组大鼠进行染色。染色实验分为两部分，上午进行实验组和对照组大鼠美蓝染色；下午进行实验组和对照组大鼠卢戈液染色。实验前先给大鼠腭部用蒸馏水冲洗，擦干，向粘膜涂擦0.5％美蓝1～3ml，1～2min后用1％的冰醋酸擦拭，并用蒸馏水冲洗，连续3次，擦干，记录颜色消失时间，观察粘膜变化过程，照相。进行卢戈液染色观察时，先用蒸馏水冲洗鼠腭粘膜，擦干，向粘膜涂擦1.5％～3.0％卢戈液1～3ml涂擦，1～2min后蒸馏水冲洗，观察粘膜的变化情况及染色程度及范围，记录颜色消失时间，照相。实验结束后处死动物，切取标本，立即放到10％的福尔马林固定液中固定。常规切片，苏木素及伊红染色，加拿大树胶封片，光镜观察结果。3．结果判断：鼠口腔粘膜癌变的判断标准：鼠口腔粘膜的组织病理改变包括上皮异常增生和口腔癌的组织分型的诊断参照WHO(2005)标准。染色结果的判断：①美蓝染色结果的评价经1％醋酸反复脱色后病损及其周围组织表面仍呈现不同程度蓝色为阳性染色(+)；记录着色程度(浅蓝，深蓝)，均质性(均质着色，斑点状、片状着色)，及染色区周界情况(周界清晰、周界不清)。经脱色后病损及周围粘膜无蓝色滞留或均匀的淡蓝色为阴性染色(—)。②Lugol’s碘液涂擦，粘膜不均质淡染或不染为阳性；均匀的棕黄着色为阴性。4．应用SPSS10.0统计软件采用x~2检验，取α=0.05为显著性检验水准。结果1．建立动物模型：随致癌剂作用时间延长，大鼠腭部粘膜相继出现白色斑块、溃疡、糜烂、颗粒状增生等改变。10周时50.0％大鼠腭粘膜表现为单纯性上皮增生，50.0％为轻中度异常增生；13周时37.5％为轻度异常增生，50.0％为中度异常增生，12.5％为重度异常增生：16周时37.5％为轻中度异常增生，37.5％为重度异常增生，25.0％为原位癌；19周时以重度异常和原位癌为主，出现1例侵袭性高分化鳞癌。第21周时37.5％为中重度异常增生，25.0％为原位癌，37.5％为侵袭性高分化鳞癌；第24周时以癌为主，87.5％为癌，重度为12.5％。2．美蓝染色对口腔癌和上皮异常增生的敏感性分别为88.9％和80.8％；卢戈液染色对口腔癌和上皮异常增生的敏感性分别为55.6％和50.0％。美蓝和卢戈液的阳性染色率具有显著性差异(P＜0.05)结论1．应用4NQO致癌剂局部涂擦Wistar大鼠腭粘膜可以成功地建立口腔腭粘膜癌变动物模型。2．鼠腭粘膜癌变是一个动态的过程，经历了鳞状上皮单纯性增生、轻度上皮异常增生、中度上皮异常增生、重度上皮异常增生和原位癌，再进一步发展至早期浸涧癌。3．美蓝和卢戈液染色观察可用于口腔粘膜上皮异常增生和癌变的早期辅助诊断。4．美蓝对病变部位染色的敏感性优于卢戈液，美蓝染色观察是早期诊断口腔癌病变的方法之一。