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中药在我国医药产业的地位举足轻重,《中医药创新发展规划纲要（2006-2020年）》中明确提出,支持中药材珍稀濒危品种保护、繁育和替代品的研究。为开发名贵中药熊胆的人工替代品,科技部经过反复考察论证,立项重大新药创制“体外培育熊胆粉关键技术及临床前研究”（2014ZX09301306）。熊胆成分复杂,其中具有药学价值的主要成分为熊去氧胆酸,是通过肠道微生物中7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）,以鹅去氧胆酸为底物转化而来。黑熊作为能够大量产生熊去氧胆酸的特殊物种,研究其肠道微生物的结构与功能,并挖掘其中酶学性质优良的7α-/7β-HSDH,具有重要的科学意义和工业价值。然而,自然界中大多数微生物是不可培养的,动物肠道复杂的厌氧环境,更加限制了对其中微生物资源的开发。对环境样品进行宏基因组测序使得我们能够更快更好地了解其微生物组结构与功能,挖掘其中的功能基因。因此,本文基于宏基因组学的研究策略,采集来自四川、云南和黑龙江三个地区黑熊粪便样品,比较不同地区黑熊肠道微生物菌群的结构特征,揭示黑熊肠道微生物的共有微生物组成,解析黑熊肠道微生物组的基因功能分布,为认识黑熊肠道微生物菌群结构及功能提供依据;在此基础之上,挖掘并表征黑熊肠道微生物来源的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因,并对得到的7α-/7β-HSDHs进行一系列酶学性质研究,筛选出具有较高活性、较强催化效率和较好热稳定性的7α-/7β-HSDH,为熊去氧胆酸的生物转化提供优质候选酶类,为体外培育熊胆粉的工业化提供物质基础。本文的主要内容和结果:（1）基于16S rRNA中V3-V4区域的序列信息,比较研究四川、云南和黑龙江三地的圈养黑熊肠道微生物菌群组成和结构,共有12个门、192个属的微生物被鉴定归类。其中,Firmicutes和Proteobateria是亚洲黑熊肠道菌群的优势菌群,这两个门的微生物广泛存在于3个实验组的所有粪便样品之中。Clostridiumsensustricto1,Turicibacter,（uncultured）Peptostreptococcaceae IncertaeSedis,Peptostreptococcaceae IncertaeSedis,Escherichia-Shigella,Clostridiumglycolicum和Streptococcus这7个属为三地圈养黑熊的肠道菌群共有微生物;菌群LefSe分析显示,各组中差异分布最显著的3个属为Escherichia-Shigella,Streptococcus和Pseudomonas;Alpha多样性分析和Beta多样性分析一致表明,四川和云南的圈养黑熊肠道微生物菌群类似,在组成和结构上无明显差别,而黑龙江的圈养黑熊具有更加丰富的菌群多样性,在组成和结构上与先前两地有明显差异,提示生物地理学等因素可能对亚洲黑熊的肠道微生物组成产生影响。上述结果为认识黑熊肠道微生物菌群结构及其特征提供依据。（2）通过宏基因组学的研究方法,对来自四川、云南和黑龙江的3个黑熊粪便样品进行高通量测序,揭示黑熊肠道微生物组中的功能特征和代谢途径。对序列进行拼接、组装和预测后,一共得到400118个ORFs,是一个巨大的微生物基因资源宝库。基于COG数据库的功能注释表明,黑熊肠道基因组中富含涉及Metabolism的功能基因,其中碳水化合物转运与代谢基因和氨基酸转运与代谢基因这两类含量最高;基于NR基因物种分类表明,3个样品中测序所得ORF基因大多来自Firmicutes;KEGG代谢网络显示,黑熊粪便宏基因组中存在丰富的碳代谢、核酸代谢和氨基酸代谢通路。上述研究为理解黑熊肠道微生物菌群功能提供一定的理论参考,也为下一步挖掘其中的新颖生物催化剂提供了数据平台。（3）采用本地BLAST对比策略,从上述所得黑熊肠道宏基因组中挖掘、克隆putative 7α-/7β-HSDH编码基因,体外表达后表征催化功能,并对蛋白序列进行生物信息学分析。共有38个putative 7α-HSDH编码基因和10个putative 7β-HSDH编码基因被发现,克隆并表达了其中具有全长序列的5个7α-HSDH编码基因和1个7β-HSDH编码基因;与课题组前期用于熊去氧胆酸生物转化的、Clostridium absonum ATCC27555来源的7α-HSDH（Clo.sa-a）和7β-HSDH（Clo.sa-b）酶活比较显示,黑熊肠道微生物组来源的7α-HSDH蛋白S1-a-1和S1-a-2显示出优越的催化活性,显著高于Clo.sa-a,黑熊肠道微生物组来源的7β-HSDH蛋白Y1-b-1也表现出良好的催化活性,与Clo.sa-b酶活相当;6个重组蛋白所催化的酶促反应产物HPLC检测再次表明,使用宏基因组技术挖掘putative 7α-HSDH和7β-HSDH的策略有效可行;蛋白同源性分析及氨基酸序列对比结果显示出6个HSDH蛋白较高的同源性及保守的SDR超家族蛋白序列特征。（4）对黑熊肠道微生物组来源于的7α-/7β-HSDHs酶学性质进行了较为系统的研究,并比较了它们与Clo.sa-a和Clo.sa-b在酶学动力学参数和热稳定性这两方面的差异。蛋白S1-a-1催化效率显著高于其它7α-HSDHs,是Clo.sa-a的10倍,Y1-b-1与Clo.sa-b催化效率相当;在实验条件下,6个HSDH蛋白的最适pH均为碱性,集中在7.5-9.0之间,最适温度集中在30-50?C之间;酶的热稳定性实验显示,5个7α-HSDH的热稳定性与Clo.sa-a相当,而Y1-b-1热稳定性优于Clo.sa-b,特别是在37?C条件下,其热稳定性明显优于Clo.sa-b。上述实验进一步筛选出了具有工业应用前景的7α-/7β-HSDH,为其后续应用提供了有意义的数据参考,同时也为开发肠道微生物的其它功能基因提供了有力借鉴。