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在全球范围内大豆疫霉引起的大豆根腐病是一种极为严重的病害,在我国每年都会造成极大的经济损失。大环内酯类抗生素勃利霉素对大豆疫霉具有非常高的抑制活性,可能成为一种新型、高效的生物农药。前期研究显示,勃利霉素可以通过与大豆疫霉的苏氨酰-t RNA合成酶形成复合体抑制蛋白的合成,本研究旨在探索勃利霉素抗大豆疫霉病的其他途径。利用生物信息学方法分析大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2基因,其与勃利霉素抑制酵母的细胞周期作用靶标Cdc28基因高度同源,通过基因工程技术分别在大肠杆菌和酵母中克隆psCdc2,体外表达、纯化获得蛋白,利用荧光光谱分析了勃利霉素与psCdc2在体外的相互作用,并利用dsRNA介导psCdc2基因沉默技术研究了该基因的突变对大豆疫霉的影响。结果如下:(1)大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2生物信息学分析结果显示,该蛋白由20种氨基酸组成,蛋白分子量为35,478Da,等电点为8.56,是稳定存在的蛋白,无信号肽,为α/β型蛋白。在大豆疫霉基因组内找到了与酵母Cdc28基因存在相互作用10个蛋白同源的大豆疫霉的蛋白,蛋白的一致性百分比在26%-46%之间,说明大豆疫霉内可能存在类似酵母细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28的蛋白相互作用网络。(2)采用反转录PCR技术得到了大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2基因,将psCdc2克隆到大肠杆菌pET 32a(+)表达载体,转化到BL21进行表达,利用低温诱导与变复性透析纯化方法获得可溶性大豆疫霉psCdc2。在大肠杆菌中表达的蛋白是以包涵体形式存在,因此将其克隆到毕赤酵母的pPIC9K表达载体中,通过电转化的方法转入毕赤酵母进行表达,利用镍柱纯化获得可溶性大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。(3)通过荧光光谱分析勃利霉素与大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2的相互作用发现,随着勃利霉素浓度的增加蛋白荧光强度不断地降低,说明两者发生了作用。而猝灭常数Ksv随着温度的升高而升高,可以推断勃利霉素对大豆疫霉psCdc2的猝灭为动态猝灭,即勃利霉素与大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2之间的相互作用是通过相互碰撞实现的。(4)体外合成psCdc2的dsRNA通过聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉原生质体转化技术转入大豆疫霉原生质体。在再生培养基上生长的psCdc2转化子菌落形态没有明显变化,但菌株的生长速率减慢,且诱导产生的孢子囊数量小且多为畸形,说明了大豆疫霉psCdc2基因的沉默会影响大豆疫霉的生长。通过体外实验证实勃利霉素与大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2之间的相互作用是通过相互碰撞实现的,且沉默大豆疫霉的psCdc2基因会影响大豆疫霉的生长与产孢。