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ε毒素(Etx)是由B型和D型产气荚膜梭菌产生的一种具有超强毒力的外毒素,属于β穿孔素家族的成员。Etx是引起家畜发生梭菌性肠毒血症的主要致病因子,动物一旦发病,死亡率几乎为100%。通过免疫接种产生针对Etx的保护性抗体是防控疾病的有效途径。本研究在分析Etx三维结构的基础上,通过对其Domain Ⅲ的芳香族氨基酸簇进行定点突变构建了一系列Etx突变体,并采用MDCK细胞毒性试验、钙离子内流试验、检测毒素在细胞膜上的结合与聚合、小鼠致死性试验等手段对Etx突变体的功能进行鉴定。结果表明,位于Domain Ⅲ的第71位酪氨酸(Y71)是影响Etx毒力的关键氨基酸,而且第71位氨基酸残基的侧链芳香环基团是毒素体外杀细胞活性和体内致死性的决定因素。为了进一步确定构建的减毒突变体作为亚单位疫苗抗原的潜力,我们选择Etx-Y71 A作为代表性突变体进行动物体内安全性和免疫原性研究。Etx-Y71A接种小鼠后的病理学观察显示,小鼠没有出现任何病理损伤;GFP荧光示踪试验也显示Etx-Y71A丧失了穿越小鼠血脑屏障的能力,表明Etx-Y71A在动物体内具有良好的安全性。同源建模和圆二色谱分析均显示Etx-Y71 A的蛋白结构与野生型Etx无明显差异,表明毒素的抗原结构无明显改变,为Etx-Y71A保留毒素免疫原性提供了结构基础。免疫保护性试验显示,Etx-Y71A能够诱导小鼠产生高水平的体液免疫反应,能使其抵抗100LD50野生型毒素的攻击;Etx-Y71A接种绵羊后能够诱导产生高滴度的Etx特异性抗体,并且这些抗体在体外和体内检测中均具有高水平的中和活性;重要的是,孕羊接种该突变体能够使新生羔羊获得被动免疫;这些结果表明Etx-Y71A具有作为亚单位候选疫苗的潜力。综上所述,本研究首次确定了位于Etx Domain Ⅲ的第71位氨基酸残基的芳香环侧链是影响Etx毒力的决定因素,填补了 Etx Domain Ⅲ结构与功能研究的空白;构建的突变体Etx-Y71A在体外和体内水平均实现减毒,并且在实验动物模型和本动物中均具有良好的免疫效力,为Etx毒素减毒亚单位疫苗的研究奠定了理论和试验基础。