第一部分兔骨髓基质干细胞的获取及生物学鉴定目的体外获取兔骨髓基质干细胞为骨组织工程研究提供种子细胞。方法取4周龄新西兰大白兔骨髓,密度梯度离心法获取BMSC,通过倒置相差显微镜、BrdU标记染色观察其形态学特征和生长状况,流式细胞仪分析其表面标志物抗原表达情况。结果分离培养的细胞在第10～12代以前生长性状稳定,增殖能力强。70%以上的BMSC细胞核被BrdU标记。流式细胞仪检测显示兔BMSC表面抗原CD44阳性细胞百分率为93.85%,CD90阳性细胞百分率为75.28%,CD34阳性细胞百分率为2.98%,CD45阳性细胞百分率为1.70%,CD11b阳性细胞百分率为0.45%,Lamine阳性细胞百分率为0.24%。结论分离培养的细胞成分较为单一,具有干细胞特性,适用于骨组织工程学研究。第二部分双功能多肽(K)16GRGDSPC的设计、合成及介导细胞特异性粘附目的制备双功能多肽(K)16GRGDSPC并评价其能否介导BMSC特异性粘附。方法设计RGD肽(K)16GRGDSPC。固相合成法合成(K)16GRGDSPC,用质谱仪和高压液相色谱仪鉴定。通过细胞粘附和粘附竞争性抑制实验评价(K)16GRGDSPC介导细胞粘附的可行性和特异性。结果质谱仪显示合成肽的平均分子量为2741.54 m/z,与理论计算分子量一致。高压液相色谱仪显示合成肽的纯度为99.2796%,完全满足实验要求。RGD肽GRGDSPC、(K)16GRGDSPC及BSA、(K)16均能促进BMSC粘附,以(K)16GRGDSPC作用最为显著;非RGD肽GRGESPC对BMSC粘附无促进作用。仅GRGDSPC、(K)16GRGDSPC可显著抑制BMSC在(K)16GRGDSPC预处理培养板的粘附,而非RGD肽GRGESPC无明显影响,BSA、(K)16甚至进一步促进BMSC在(K)16GRGDSPC预处理培养板的粘附。结论(K)16GRGDSPC易于合成,可以通过RGD结构域介导BMSCs特异性粘附。第三部分多肽(K)16GRGDSPC介导基因转染及影响因素目的评价多肽(K)16GRGDSPC作为一种非病毒载体介导基因转染的可行性及其介导基因转染的靶向特异性;探讨优化(K)16GRGDSPC介导基因转染的各种影响因素。方法用(K)16GRGDSPC介导报告基因虫荧光素酶质粒和绿色荧光蛋白质粒转染BMSC,通过液闪计数仪和荧光显微镜观察基因表达。流式细胞仪检测基因转染效率,并与商业化脂质体Lipofetamine 2000的转染效率进行比较。通过转染竞争性抑制实验检测(K)16GRGDSPC介导基因转染的靶向特异性。在保持其它因素一致的条件下,通过变化单一因子来评估其影响并优化该参数。结果虫荧光素酶pGL3质粒和EGFP质粒均能在BMSC内表达。FCM显示(K)16GRGDSPC的转染效率为19.47%,与Lipofectamine 2000的转染效率19.98%无显著性差异(P>0.05)。加入含RGD肽GRGDSPC和(K)16GRGDSPC使虫荧光素酶的表达活性明显下降;而非RGD肽GRGESPC对转染无明显影响。在(K)16GRGDSPC介导基因转染的过程中,氯喹和PEI均可以改善其基因转染效率。尤其是氯喹,对多肽载体介导基因转染起着不可或缺的作用,BMSCs在氯喹溶液中的暴露时间至少应维持在8h以上;在载体/质粒复合物中暴露时间过短(<4h)或过长(>24h)对转染都有不利影响;质粒浓度在2～4μg时转染效果最佳;载体/质粒质量比为3:1时有最高的转染效率;血清对质粒/载体复合物与细胞的结合有明显抑制作用;膜融合肽P20对基因转染效率也有促进作用,但仅约为氯喹的75%;脂质体Lipofectamine和多肽对基因转染有明显的协同作用;加入转铁蛋白也能显著提高基因的转染和表达,且在25μg/ml时转染效率达到最高。结论多肽(K)16GRGDSPC不仅可以作为一种RGD肽介导细胞特异性粘附,还可以作为一种非病毒载体介导靶向特异性基因转染并获得理想的转染效率。优化转染条件可提供改善多肽载体转染效率的多种策略,为多肽载体在基因转染领域的开发应用和本实验下一步进行基质材料表面基因修饰研究奠定了理论基础。第四部分载基因仿生基质材料的制备及介导基因转染目的制备载基因仿生基质材料并检测其能否介导外源基因转染。方法通过交连剂Sulfo-LC-SPDP将非病毒载体(K)16GRGDSPC共价接枝到骨基质材料PLGA-[ASP-PEG]支架材料上构建非病毒基因转染体系,XPS图谱检测接枝反应的发生。将BMSC与其复合培养,扫描电镜观察细胞生长情况,通过沉淀法、微管吮吸法检测细胞粘附性能的变化。激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架主要成分肌动蛋白(F-actin)的形态。该非病毒基因转染体系与TGF-β1基因复合制备载基因仿生基质材料,将兔BMSC与其复合培养,通过RT-PCR、Western Blot、ELISA及免疫组化染色检测TGF-β1基因的表达。结果XPS图谱证实含RGD肽(K)16GRGDSPC被成功地接枝到PLGA- [ASP-PEG]表面。细胞粘附性能和粘附强度显著改善。RT-PCR、Western Blot、ELISA以及免疫组化检测均显示TGF-β1基因在BMSC内表达。结论这种载基因基质材料作为一种基因活化基质,可以作为一种非病毒载体介导外源基因转染。第五部分载基因仿生基质材料调控BMSC成骨定向分化目的评价载基因仿生基质材料能否调控骨髓基质干细胞(BMSC)向成骨细胞定向分化。方法制备载基因基质材料并与BMSC复合培养,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)、考马斯亮蓝法和流式细胞仪(FCM)检测细胞体外增殖活性,并进行成骨诱导扩增,检测转基因细胞成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、核心结合因子a1(Cbfa1)的表达及矿化情况。FCM分析DNA含量和细胞骨架染色评估载基因基质材料的安全性。结果载基因基质材料复合培养细胞的体外增殖活性明显高于对照组(P<0.01);经成骨诱导后其成骨特征性表型(ALP、OCN、OPN和CollⅠ、Cbfa1)的表达及矿化与对照组有显著的差异(P<0.01);细胞与载基因基质材料长期复合培养后无异倍体,细胞骨架形态正常。结论载基因基质材料可以调控BMSC向成骨细胞方向定向分化;TGF-β1可以作为理想的调控因子之一。