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骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是多种因素共同作用下所致的退行性关节疾病,主要表现是关节疼痛和活动受限,最终导致患者活动能力下降甚至丧失。OA在老年人群中的发病率很高,据报道,我国60岁以上人群中,OA的发病率达50%,而75岁以上人群中,其发病率高达80%,且近年来OA的发病率和致残率仍在不断升高。此外,由于疾病早期缺乏症状而不易察觉,当出现明显症状时疾病多进入中晚期,软骨已发生不可逆性损害。因此多数患者因为疼痛、关节功能丧失而不得不接受人工关节置换手术。由此可见,OA已经成为威胁老年人群公共健康和生活质量的重大医学问题。蛋白聚糖酶(aggrecanase)是近几年最新克隆分离出的酶类,是带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)家族成员。近期研究发现 aggrecanase-1(ADAMTS-4)与aggrecanse-2(ADAMTS-5),OA疾病早期就参与了软骨蛋白聚糖(aggrecan)的降解,与疾病的发生发展有着密切的联系,而同时抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5可以有效防止OA软骨细胞外基质(ECM)降解,防止软骨的退行性变。组织因子机制金属蛋白酶抑制剂-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3)已被证明对于ADAMTS-4/5的活性具有较强的抑制作用,是关节软骨中ADAMTS-4/5的天然抑制剂,调节其活性。因此,ADAMTS/TIMP-3系统平衡对OA的发展起着至关重要的作用。而将此系统作为药物干预的靶点,从而观察经过干预后对疾病发展的作用,已经成为新型抗OA药物研制的策略。脱氢表雄酮(DHEA)是肾上腺皮质网状带分泌的一种甾体类激素,它在血浆中的浓度随着年龄的增长而降低。近几年,国外有学者开始从事DHEA离体实验和在体实验的研究,其研究结果提示DHEA对OA关节软骨可能有保护作用,然而具体机制尚不明确。本研究通过建立新西兰大白兔膝OA模型,并研究关节腔内注射DHEA对退变关节软骨的作用,并探讨相关作用机制。本次研究主要分成四部分:一、首先明确新西兰大白兔OA模型随疾病发展关节软骨形态学改变特征。二、脱氢表雄酮对兔中期及晚期OA的软骨形态学改善作用。三、脱氢表雄酮对兔OA软骨ADAMTS/TIMP-3酶系统的影响。我们的研究结果表明DHEA对OA关节软骨具有保护作用,且这种保护作用具有时间依赖性和部位特殊性,而其中的作用机制可能是通过抑制软骨中的侵袭因子ADAMTS-4和ADAMTS-5的分泌,促进保护因子TIMP-3、TGF-β1的表达,阻止细胞外基质主要成分Aggrecan及Collagen Ⅱ的降解来实现的。本研究结果为临床治疗OA提供了 一种新思路。第一部分新西兰大白兔OA模型建立及疾病发展特征目的:观察前交叉韧带离断法(ACLT)建立新西兰大白兔模型关节软骨形态学改变的特征。方法:正常新西兰大白兔采用3%戊巴比妥钠静脉麻醉,双侧膝关节常规消毒铺巾后行ACLT,术后分笼不制动饲养。分别在术后9周和16周麻醉处死后,迅速解剖双侧膝关节,将膝关节置于显微外科用手术显微镜下肉眼进行软骨大体形态损伤评分。结果:在ACLT后9周,我们发现关节软骨表层不平整,表中层番红染色减退,软骨细胞排列不规则(相当于中期OA的表现)。在ACLT后16周,软骨全层破坏,部分标本可见软骨下骨外露以及关节边缘的巨大骨赘,软骨细胞排列紊乱,软骨全层番红染色丢失(相当于晚期OA的表现)。结论:ACLIT术后,关节软骨进行性退变,随着饲养的时间增加,OA的病理改变也逐渐加重。第二部分脱氢表雄酮对兔OA中期及晚期的软骨形态学改善作用目的:明确关节腔内注射DHEA对中期及晚期OA关节软骨的形态学改善作用,并明确这种形态学改善作用的特征。方法:30只成年雄性新西兰大白兔纳入实验,其中20只行双侧膝ACLT造成关节不稳建立动物膝OA模型。术后4周,所有模型动物左膝关节腔内注射100 μmol/L DHEA(实验组),右膝关节腔内注射相同剂量的0.9%生理盐水(NS),每周1次。其中半数模型动物于术后9周随处死,剩下的动物于术后16周处死并获取双侧膝关节标本。另外10只兔子作为对照,接受左膝关节假手术处理,并分别于术后9周及术后16周处死获取标本。所有膝关节标本的股骨内髁(MFC)、股骨外髁(LFC)、胫骨内坪(MTP)以及胫骨外坪(LTP)分别进行大体评分及组织病理学Mankin评分。结果:假手术组膝关节软骨股骨髁及胫骨坪软骨未见明显组织学破坏,软骨表明光滑平整。所有进行ACLT的膝关节软骨呈现出不同程度的软骨损害改变。与安慰剂组相比,DHEA关节腔内给药在术后9周显著减轻了膝关节双侧间室的软骨退行性改变。与安慰剂组相比,DHEA关节腔内给药在术后16周仅仅减轻了膝关节外侧间室软骨破坏,而对内侧间室软骨无明显改善作用结论:DHEA对OA软骨形态学改善作用具有时间依赖性和部位特殊性。DHEA对中期OA关节软骨具有最为显著的形态学改善作用。第三部分脱氢表雄酮对兔骨关节炎软骨ADAMTS/TIMP-3酶系统的影响目的:观察关节腔内注射脱氢表雄酮(DHEA)对兔骨关节炎(OA)模型ADAMTS/TIMP-3酶系统的影响,并探讨其作用机制。浙江大学博士学位论文方法:对经过手术建模大白兔分为DHEA干预组和安慰剂组,股骨内髁软骨组织行羟脯氨酸(Hyp)及糖胺聚糖(GAG)含量测定,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测关节软骨中蛋白聚糖酶-1(ADAMTS-4/aggrecanase-1)、蛋白聚糖酶-2(ADAMTS-5/aggrecanase-2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-3(TIMP-3)、转化因子-β1(TGF-β1)、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(Co11agenⅡ)的表达,用免疫印迹(Western blot)法检测关节软骨中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖裂解片段(Aggrecan ARGxx)的表达。结果:DHEA处理可以显著上调Hyp和GAG含量,下调ADAMTS-4、ADAMTS-5的 mRNA 表达,上调 TIMP-3、TGF-β1、Aggrecan、Collagen Ⅱ 的 mRNA 表达,DHEA处理可以显著抑制Aggrecan ARGxx的蛋白表达,并提高Collagen Ⅱ(2.28±0.69)蛋白表达。结论:DHEA对OA关节软骨具有保护作用,可延缓OA的进展,其具体分子机制与正性调节ADAMTS/TIMP-3系统密切相关。