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背景椎间盘退变(intervertebral disc degeneration.IDD)是引起下腰痛 Clow back pain,LPB)的主要原因,目前缺乏长期而有效的治疗方法。近年来,活化募集椎间盘干/祖细胞,为椎间盘内源性修复提供了新的治疗策略。研究表明,损伤组织表达分泌的趋化性因子在自我修复过程中发挥重要作用。其中,基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)通过与C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4,CXCR4)结合调节干细胞的增殖、迁移和分化等,具有良好的生物学功能。虽然SDF-1α也在退变椎间盘中高度表达,但它对椎间盘内源性干/祖细胞的生物学作用及潜在机制尚不明确。目的1、证实退变椎间盘高表达SDF-1α及髓核干细胞(nucleus pulposus-derived stem cells,NPSCs)内源性表达CXCR4;2、研究SDF-1/CXCR4轴对NPSCs增殖活力、成软骨分化及迁移能力的影响;3、明确自噬在SDF-1/CXCR4轴介导NPSCs迁移中的作用;4、探讨SDF-1/CXCR4轴调控NPSCs自噬活性及细胞迁移的信号通路方法1、采用差速贴壁法分离纯化大鼠NPSCs后,进行干细胞生物学特性鉴定。利用实时定量 RT-PCR、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫组化,比较SDF-1α在正常和退变椎间盘组织细胞中表达的差异。通过CCK-8和EdU细胞增殖试验,流式细胞检测细胞周期分布及Annexin V/PI染色情况,分析SDF-1α对NPSCs细胞增殖活力及凋亡的影响。通过诱导NPSCs成软骨分化,检测SDF-1/CXCR4轴对软骨标志物表达的影响。2、除划痕实验和Transwell细胞迁移实验外,通过观察NPSCs分别在牛尾椎间盘离体器官模型和大鼠退变尾椎间盘内的迁移情况,评价SDF-1/CXCR4轴对NPSCs在体外、体内迁移能力的影响。通过实时定量RT-PCR、Western blot和免疫荧光,检测CXCR4在NPSCs中的表达变化,分析SDF-1/CXCR4轴在NPSCs迁移过程中的作用。3、通过观察自噬体(autophagosome)形成及自噬相关蛋白表达变化,评价SDF-1/CXCR4轴对NPSCs自噬活性的影响。经雷帕霉素(rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)处理后,通过体外迁移实验评价mTOR(mammalian target of rapamycin)通路和自噬活性对NPSCs迁移能力的影响。此外,通过观察mTOR/p70 S6K活化水平与F-actin细胞骨架重塑、自噬表达水平之间的关系,进一步明确SDF-1/CXCR4轴诱导NPSCs迁移的潜在机制。结果1、通过干细胞鉴定,证实分离培养的NPSCs具有集落形成、三系分化能力及高表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)特异性表面标志物。SDF-1α在退变椎间盘组织和细胞中的表达和分泌水平显著上调。2、除提高后期增殖活力和成软骨分化能力外,SDF-1α还能增强NPSCs在体外、体内的迁移能力。SDF-1α不仅增加NPSCs的CXCR4表达量,而且促进CXCR4从胞质转移至胞膜,同时伴有F-actin细胞骨架重组。此外,拮抗剂AMD3100有效抑制SDF-1α诱导的软骨分化和迁移能力。3、随着SDF-1α浓度增加,NPSCs的自噬活性逐渐减弱。AMD3100显著抑制SDF-1α介导的mTOR通路激活及自噬表达下调。雷帕霉素抑制SDF-1α诱导的NPSCs迁移,而3-MA促进SDF-1α诱导的NPSCs迁移。此外,SDF-1/CXCR4轴激活下游mTOR/p70 S6K信号通路,参与F-actin细胞骨架重组及抑制NPSCs自噬活性。结论1、退变椎间盘高表达分泌趋化因子SDF-1α,椎间盘内源性干细胞NPSCs内源性表达受体CXCR4。2、SDF-1/CXCR4轴促进NPSCs增殖、软骨分化及迁移能力,有助于椎间盘原位修复与再生。3、SDF-1α诱导NPSCs迁移可能与SDF-1/CXCR4轴激活下游mTOR/p70 S6K通路及抑制自噬活性有关。4、在椎间盘退变早期,SDF-1α通过激活募集椎间盘内源性干/祖细胞,具有促进内源性椎间盘修复的潜能,为原位组织工程修复椎间盘提供了新的治疗靶点。