刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人畜共患细胞内寄生原虫,所致的弓形虫病呈世界性分布。刚地弓形虫感染所诱导的免疫应答比较复杂,免疫应答的结果与疾病的发生、发展密切相关。在机体免疫功能正常时,刚地弓形虫感染一般仅造成隐性感染状态,但在宿主免疫功能低下时可造成严重后果。妇女在妊娠期间感染刚地弓形虫可引起流产、胎儿先天性异常等多种不良妊娠结局。近年来,随着肿瘤患者、艾滋病人及宠物饲养爱好者的逐渐增多,刚地弓形虫的危害也日益突出,但至今仍无治疗弓形虫病的安全有效药物,因此,深入了解刚地弓形虫感染的免疫应答机制对于弓形虫病的防治具有重要意义。研究表明,NK细胞是刚地弓形虫感染早期IFN-γ的主要来源,在机体抵抗弓形虫感染的天然免疫应答中发挥着重要作用,而抗原提呈细胞(APCs)分泌的IL-12对NK细胞产生IFN-γ起关键性作用。进一步研究发现,髓样分化因子88(MyD88)依赖的Toll样受体(TLR)信号通路对APCs产生IL-12尤为重要,在IFN-y依赖的宿主抗弓形虫感染过程中发挥着非常重要的作用。一般认为,MyD88缺陷(MyD88-/-)、鼠对刚地弓形虫易感主要是由MyD88缺陷导致APCs分泌IL-12减少所致,但是最近有研究发现,MyD88-/-小鼠在刚地弓形虫感染后给予IL-12治疗并不能阻止其急性死亡。而树突状细胞MyD88-/-(DC-Myd88-/-)小鼠虽然在弓形虫感染后同样不能产生IL-12,但短期的IL-12治疗却可以使其NK细胞恢复产生IFN-y,阻止其急性死亡的发生。这些研究结果提示,在刚地弓形虫感染早期,除了APCs的TLR/MyD88信号外,NK细胞自身的TLR/MyD88信号通路在IL-12依赖的IFN-γ产生过程中可能发挥重要作用。为了验证这一假说,我们首先研究了在IL-12存在的情况下,刚地弓形虫抗原能否在体外直接刺激NK细胞活化并分泌IFN-γ,同时对NK细胞的杀伤功能进行了评估；其次,我们探讨了NK细胞的TLR/MyD88信号在刚地弓形虫抗原组合IL-12诱导NK细胞分泌IFN-γ过程中的作用,并对MyD88接头蛋白下游多个信号通路进行了分析；再次,我们研究了小鼠NK细胞的TLRs表达情况,并对刚地弓形虫抗原组份中能够诱导NK细胞分泌IFN-γ的效应分子进行了鉴定；最后,通过NK细胞过继转移试验建立NK细胞MyD88-/-小鼠模型,进一步证实NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IL-12依赖的IFN-γ的产生过程中的作用。本研究获得如下主要结果：1.刚地弓形虫抗原和IL-12能够协同诱导高度纯化的NK细胞活化并分泌IFN-γ免疫磁珠结合流式细胞术从小鼠脾脏分选NK细胞(细胞纯度>99%),采用刚地弓形虫抗原(排泄分泌抗原/可溶性虫体抗原,ESA/STAg)和IL-12进行刺激培养。培养上清的ELISA检测结果显示,刚地弓形虫ESA和STAg均能够诱导NK细胞分泌低水平的IFN-γ,加入外源性IL-12可显著提高NK细胞的IFN-γ分泌水平,且IFN-γ的分泌与刚地弓形虫抗原之间呈浓度依赖性。NK细胞II FN-γ mRNA检测结果亦表明,刚地弓形虫抗原和IL-12能够协同诱导NK细胞产生IFN-γ。然而与IFN-γ的产生情况不同,无论是否存在外源性IL-12,刚地弓形虫抗原均只能诱导NK细胞产生低水平的TNF-α。除了检测细胞因子的分泌情况外,我们同时还分析了NK细胞的活化状态,采用流式细胞仪检测NK细胞表面活化分子CD69和CD25的表达水平,结果表明,刚地弓形虫抗原和IL-12刺激均能够增加NK细胞表面活化分子CD69和CD25的表达水平,当刚地弓形虫抗原和IL-12联用时,CD69和CD25活化分子的表达水平最高。2.刚地弓形虫抗原处理不增加NK细胞的杀伤活性因为刚地弓形虫抗原组合IL-12能够诱导NK细胞活化并分泌大量IFN-γ,所以我们进一步评估了刚地弓形虫抗原处理对NK细胞杀伤活性的影响。结果显示,未刺激的NK细胞对小鼠淋巴瘤YAC-1细胞具有轻度杀伤作用,而刚地弓形虫抗原处理并不能进一步增加NK细胞对YAC-1细胞的杀伤功能,而且,刚地弓形虫抗原和IL-12在诱导NK细胞杀伤活性方面不存在协同效应。与杀伤功能试验结果相一致,流式细胞仪检测结果表明,刚地弓形虫抗原和IL-12处理同样不能增加NK细胞活化性受体NKG2D的表达水平。3.NK细胞的TLR/MyD88信号在刚地弓形虫抗原诱导其产生IFN-γ的过程中发挥关键性作用NK细胞MyD88接头蛋白阻断试验结果显示,在培养体系中加入MyD88接头蛋白抑制肽能够显著降低NK细胞的IFN-γ mRNA表达水平。我们进一步从MyD88-/-小鼠脾脏分选NK细胞,采用刚地弓形虫抗原组合IL-12进行刺激培养,结果发现,MyD88-/-的NK细胞在刚地弓形虫抗原刺激后其IFN-γ mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组水平。这些研究结果表明,MyD88接头蛋白在诱导NK细胞分泌IFN-γ的信号级联反应中发挥重要的作用。除了TLRs外,IL-1R/IL-18R家族同样为MyD88依赖性受体,为了评估NK细胞产生IFN-γ是否可能为流式细胞仪分选细胞中的少量污染细胞所产生的IL-1或IL-18所介导,我们在刚地弓形虫抗原组合IL-12对NK细胞进行刺激培养的同时,在培养体系中加入了抗小鼠IL-α、IL-1β和IL-18中和抗体,进一步评估NK细胞的IFN-γ分泌水平。结果发现：在培养体系中加入抗小鼠IL-1α、IL-1β或IL-18中和抗体并不能降低NK细胞的IFN-y分泌水平,提示刚地弓形虫抗原诱导NK细胞分泌IFN-γ并不依赖IL-1R/IL-18R家族信号,而是由TLR/MyD88信号通路所介导的.4. p38 MAPK、ERK、JNK和NF-κB多个信号通路参与了NK细胞IFN-γ的产生MyD88介导的信号通路可以活化多个蛋白激酶和转录因子,为了进一步明确哪些途径参与了刚地弓形虫抗原诱导的NK细胞IFN-γ产生,我们进行了信号通路抑制试验。结果发现,在培养体系中加入p38 MAPK、ERK、JNK和NF-κB抑制剂均可显著抑制刚地弓形虫抗原诱导的NK细胞IFN-γ产生,且具有浓度依赖效应。其中以NF-κB抑制剂的抑制效果最为明显,在较低的使用浓度(0.5～1μM)下即可产生将近100%的抑制效果。5.刚地弓形虫profilin和热休克蛋白70 (HSP70)组合IL-12诱导NK细胞分泌IFN-γ为了鉴定刚地弓形虫抗原组份中能够诱导NK细胞分泌IFN-γ的效应分子(TLR配体),我们首先研究了NK细胞的TLRs表达情况,发现除了TLR5之外,C57BL/6小鼠脾脏NK细胞表达所有TLR1～4、TLR6-9和TLR11～13的mRNA。TLR s在发挥生物学效应时可能通过改变自身表达水平来调节其效应功能,为了鉴定在弓形虫抗原诱导NK细胞分泌IFN-γ过程中可能发挥作用的TLRs,我们分析了NK细胞在弓形虫抗原刺激后TLRmRNA表达水平的变化,结果显示,TLR1～9、TLR11～13的mRNA表达水平在抗原刺激前后均无显著变化。已有许多研究报道了其它免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞等)中的TLRs在弓形虫感染免疫应答中的作用,而且对应的虫源性配体已经明确。所以我们克隆表达了刚地弓形虫profilin和HSP70,并提取刚地弓形虫糖基磷脂酰肌醇(GPIs),进一步研究这些已经明确的虫源性TLR配体能否诱导NK细胞分泌IFN-γ。结果表明,刚地弓形虫profilin和HSP70组合IL-12能够诱导NK细胞分泌大量IFN-γ,而刚地弓形虫GPIs不能刺激NK细胞产生IFN-γ。从MyD88-/-小鼠脾脏分选NK细胞进行刺激试验发现,刚地弓形虫profilin和HSP70同样通过NK细胞的TLR/MyD88信号通路来诱导其分泌IFN-γ。最后,通过制备profilin和HSP70多克隆抗体,对弓形虫抗原进行Western blot鉴定发现,profilin仅存在于STAg,而HSP70则同时存在于ESA和STAg中。6.NK细胞的TLR/MyD88信号通路在机体抗弓形虫感染的天然免疫应答中发挥重要作用我们通过NK细胞体内过继转移试验进一步证实NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IFN-γ产生过程中的作用。结果显示,与过继野生型(WT)NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠(T、B、NK联合免疫缺陷)相比,过继MyD88-/- NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠在刚地弓形虫感染后,其血清IFN-γ水平显著降低,脾脏寄生虫荷也更高。同时,过继MyD88-/-N K细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠比过继野生型(WT)NK细胞的NOD/SCID-β2m-/-小鼠在一定程度上更容易发生死亡。这些研究结果说明,NK细胞的MyD88信号在刚地弓形虫感染早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。而已有研究结果表明,IL-1R/IL-18R信号在IFN-γ依赖的宿主抗弓形虫感染过程中并不发挥关键性作用,这就提示,NK细胞的TLR/MyD88信号通路在机体抗弓形虫感染的天然免疫应答,特别是早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。综上所述,本研究通过体外、体内试验证实了NK细胞的TLR/MyD88信号通路在刚地弓形虫感染早期IFN-γ的产生过程中发挥重要作用。因为除了刚地弓形虫外,NK细胞产生IFN-γ在其它多种病原体感染的天然免疫应答中都发挥重要作用,所以,本研究结果将有助于我们从一个新的角度去认识这些病原体感染的天然免疫应答过程。