研究背景虽然恶性肿瘤的治疗已经有了飞跃式的进步,但无论是放化疗,还是靶向治疗以及免疫治疗,都会衍生多药耐药(multidrug resistance,MDR),即在临床治疗过程中,肿瘤对一线化疗药物产生了耐药,代谢、基因突变等多种机制介导细胞对其它结构和作用机制完全不同的药物也产生抗药性,使之无法发挥抗肿瘤作用,产生多药耐药。多药耐药不仅严重制约临床的治疗效果,而且药物本身的各种毒副作用也严重影响患者的生存质量。因此克服耐药、降低药物的毒副作用一直是肿瘤治疗领域关注的重要问题,细致探讨肿瘤耐药的机制,是发现新的治疗靶点及逆转剂的关键,也是为抗肿瘤药物合理用药提供思路。肺癌是全世界高发病率、高死亡率的恶性肿瘤,放化疗、免疫治疗是转移性肺癌的主要治疗手段,和其它肿瘤一样,治疗失败的重要原因之一是耐药性的产生。由于化疗依然是肺癌的一线治疗手段,对其耐药的机制也较为深入,目前克服肺癌化疗耐药的策略主要有:1)研究耐药机制,发现新的逆转药物,例如,药泵蛋白P-gp高表达是多西他赛(docetaxel,Doc)的耐药机制之一,而卡巴他赛(Cabazitaxel)对P-gp的亲和力低,可作为治疗方案用于对Doc耐药患者;2)选择新的治疗方案,例如,一线化疗失败后采用免疫治疗,这也是新型的逆转方法;3),选择无交叉耐药的联合化疗方案,例如,在以铂类药物为主的一线化疗失败后,可采用多西他赛(docetaxel,Doc)进行治疗,而且二者进行交叉治疗的肺癌患者生存期得到延长[1]等。本研究论文发现内质网蛋白reticulocalbin-1(RCN1)在肺癌中高表达,而且RCN1在多种肿瘤耐药细胞中的表达显著升高、与肿瘤细胞耐药性密切相关。因此我们重点探讨RCN1在肺癌耐药中的作用,并通过筛选降低RCN1的药物,发现HDAC抑制剂能显著降低RCN1的表达、且能增加耐药细胞对化疗药物、特别对多柔比星的敏感性,降低其毒性的作用,并对HDAC抑制剂能显著降低RCN1表达的机制进行初步探讨。RCN1作为内质网蛋白,其生理病理功能研究不多,主要集中于肿瘤中的表达,本论文通过研究RCN1与肿瘤多药耐药中的关联以及对化疗药物的影响,为耐药肺癌患者的临床用药提供新的依据。研究内容第一部分内质网蛋白RCN1介导肺癌的多药耐药一、RCN1在肺癌中高表达,并与细胞的存活有关我们课题组前期已发现RCN1在多种肿瘤细胞高表达,包括前列腺癌、肺癌等。本论文首先分析验证RCN1不同类型肺癌细胞的表达,结果显示,RCN1在永生化支气管上皮细胞HBE、小细胞肺癌细胞(H1688、H446)及非小细胞肺癌细胞(A549、H460、H1299)呈不同程度的表达。进一步分析肺癌组织样本RCN1的蛋白表达情况。免疫组化实验结果发现,肺癌组织中RCN1蛋白的表达比癌旁组织明显升高,表明RCN1可能与癌症的发生有关。利用TCGA数据库进行RCN1表达和肺癌患者生存分析,结果显示RCN1表达与肺癌患者的生存成显著负相关。下调肺癌细胞RCN1的表达,A549、H1688细胞的存活率显著降低。因此,RCN1在肺癌组织及细胞高表达,与患者生存期呈显著负相关,也与肺癌细胞存活相关。二、RCN1在不同类型肿瘤耐药细胞的表达显著升高,且与耐药有关1、RCN1在多种肿瘤耐药细胞的表达显著升高,降低RCN1的表达抑制耐药细胞的存活我们利用经紫杉醇诱导人肺癌细胞H460和A549产生的多药耐药细胞H460/Tax和A549/Tax、人前列腺癌PC3细胞经多西他赛诱导的耐药细胞PC3/Doc、人口腔癌细胞KB经长春新碱诱导的耐药细胞KB/VCR进行RCN1的表达分析,结果显示,和相应的敏感细胞株相比,RCN1耐药细胞的表达进一步提高,而下调RCN1的表达,显著抑制耐药细胞的存活。2、RCN1表达对化疗药物药效的影响通过MTT实验检测细胞RCN1表达降低、或者升高对化疗药物药效的影响。我们选择常用化疗药物多西他赛(Doc)、VP16、5-氟尿嘧啶(5-Fluoropyrimidine,5-Fu)以及吉西他滨(Gemcitabine,GEM)。结果发现H446细胞过表达RCN1后,细胞对上述药物的敏感性均有不同程度的降低,表明RCN1过表达可能与细胞耐药有关。我们利用A549/Tax耐药细胞降低RCN1的表达,分析耐药细胞对药物的应答情况,结果显示,耐药细胞下调RCN1增加对顺铂(cisplatin,CDDP)、多柔比星(Doxorubicin,Doxo)的敏感性;反之,A549细胞过表达RCN1后细胞对药物的抵抗作用略有增加。表明耐药细胞中RCN1表达上调参与细胞的耐药过程。第二部分HDAC抑制剂下调RCN1的作用机制及对化疗药物的增敏效应由于RCN1表达上调导致细胞产生耐药,我们从常用药物中筛选能够下调RCN1表达的小分子化合物,通过药物联用的方式,探讨逆转RCN1介导耐药的可能性。一、HDAC抑制剂在转录水平抑制肺癌细胞中RCN1的表达1、筛选下调RCN1的小分子药物我们选择肺癌治疗药物及其它常用药物或抑制剂进行初步筛选,包括:1)DNA损伤药物,顺铂(CDDP)、多柔比星(Doxo);2)微管靶向药物多西他赛(Doc);3)表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物,吉非替尼(gefitinib,Gefi);4)HDAC 抑制剂(HDACi),Trichostatin A(TSA),Vorinostat(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA),结果显示,RCN1呈现两条带(分子量较小的条带为total RCN1,分子量较大的条带为糖基化的RCN1),gefitinib、docetaxel有上调RCN1趋势,而HDAC抑制剂TSA、SAHA均能显著下调RCN1。我们利用A549及耐药A549/Tax细胞进一步确定TSA和SAHA对RCN1的抑制作用具有浓度依赖性。因此,HDAC抑制剂能显著下调RCN1的表达,可能是HDAC抑制剂逆转耐药的机制之一。2、HDAC抑制剂下调RCN1表达的机制由于HDAC抑制剂TSA、SAHA能在转录、蛋白水平通过多种机制调控靶基因的表达,我们将从蛋白降解以及转录两方面分别探讨HDAC抑制剂下调RCN1表达的机制。(1)HDAC抑制剂不影响RCN1的翻译 我们利用耐药细胞A549/Tax首先分析RCN1的蛋白半衰期,加蛋白合成抑制剂放线菌酮CHX时,RCN1的半衰期大约在12h,而在HDAC抑制剂存在的情况下,RCN1的半衰期并无显著变化,表明HDAC抑制剂不影响RCN1的蛋白合成。(2)HDAC抑制剂诱导的自噬不影响RCN1的表达 由于TSA和SAHA可通过自噬机制发挥抑制蛋白水平的作用,我们首先分析SAHA是否通过诱导自噬、促进RCN1的降解而发挥下调RCN1的作用,结果显示,SAHA可显著诱导LC3II、降低P62及NBR1的蛋白水平,表明SAHA可激活自噬,当利用羟基氯奎(HCQ)阻断自噬,并不逆转SAHA对RCN1的抑制作用。同样饥饿、硼替佐米诱导的自噬对RCN1的降解无显著影响。因此SAHA可能不通过抑制RCN1的蛋白合成与降解而发挥下调RCN1的作用,而RCN1的降解途径还需进一步深入探讨。(3)HDAC抑制剂转录抑制RCN1的表达 由于HDAC抑制剂不影响RCN1的蛋白水平,而且HDAC抑制剂的主要作用是调控组蛋白乙酰化、影响基因的转录。因此我们分析HDAC抑制剂对RCN1的mRNA的影响。结果显示,SAHA显著降低RCN1在不同细胞中的转录,并呈浓度依赖性,表明SAHA抑制RCN1的基因表达。我们进一步分析RCN1的启动子,有多个转录因子的结合位点,包括 SP1、Myc、TFAP4、c-Jun、GATA2、NF-κB 等,耐药细胞经 SAHA 处理后分析各转录因子的变化,发现SAHA可显著抑制Myc、TFAP4以及p65(NF-κB的亚基)。过表达TFAP4、p65可不同程度的逆转SAHA对RCN1的抑制作用,表明SAHA通过抑制转录因子p65和TFAP4的表达,进而发挥抑制RCN1 mRNA的转录。二、HDAC抑制剂下调RCN1的作用可增加耐药细胞对多柔比星的敏感性1、HDAC抑制剂联用药物的筛选由于RCN1高表达介导肿瘤耐药,而HDAC抑制剂可下调RCN1的表达,HDAC抑制剂是否通过联用化疗药物逆转肿瘤的耐药?我们首先进行联用药物筛选,药物联用的CI曲线结果显示,HDAC抑制剂与doxorubicin、gemcitabine、cisplatin联用对敏感细胞A549都呈现良好的抑制效果,而对耐药细胞A549/Tax,HDAC抑制剂与doxorubicin、gemcitabin具有良好的联用效果,特别是与doxorubicin的联用最佳。2、动物实验证实HDAC抑制剂联用多柔比星具有一定的逆转耐药作用在裸鼠皮下注射肺癌细胞A549及其耐药株A549/Tax构建肺癌细胞荷瘤小鼠模型,分析SAHA与doxorubicin联合用药的抗肿瘤效果,结果表明,SAHA单独给药耐药细胞A549/Tax的瘤组织有抑制作用,doxorubicin对敏感细胞的抑瘤效果优于耐药细胞,而SAHA与doxorubicin联用对耐药细胞组有显著的抑瘤作用,显著降低Ki67阳性染色细胞、发挥抑制增殖的作用。3、HDAC抑制剂联用doxorubicin显著降低RCN1、转录因子P65和TFAP4的表达无论是敏感细胞荷瘤组还是耐药细胞荷瘤组,doxorubicin都有一定的促进RCN1表达的作用,而SAHA及联用组均下调RCN1的表达,同时也降低转录因子p65、TFAP4的表达,表明SAHA抑制RCN1的作用参与其逆转耐药的过程。结论1.RCN1在肿瘤组织高表达,与细胞存活有关,但与患者的生存无显著相关性。2.耐药的肿瘤细胞RCN1表达显著升高,参与肿瘤细胞的耐药,下调RCN1可增加细胞对药物的敏感性。3.HDAC抑制剂通过抑制转录因子p65、TFAP4的表达而发挥转录抑制RCN1表达的作用。4.HDAC抑制剂SAHA与多柔比星联用具有一定的逆转耐药的作用,而SAHA下调RCN1的作用可能是逆转耐药的机制之一。创新点与不足1.创新点:(1)RCN1高表达参与肿瘤的耐药,而下调RCN1可增加细胞对药物的敏感性。RCN1可能是肿瘤耐药的治疗靶点。(2)HDAC抑制剂可下调RCN1表达,并增加耐药细胞对多柔比星的敏感性,二者联用对耐药细胞的增殖及瘤组织的生长具有显著的抑制作用。为临床治疗中克服肿瘤多药耐药提供新思路。2.不足之处(1)RCN1介导的多药耐药机制尚未进行探讨,初步的数据表明可能与RCN1促进DNA损伤修复有关,需进一步研究。(2)SAHA抑制RCN1的机制研究较为单薄,尚需进一步探索。(3)RCN1的蛋白降解途径尚未阐明,需要细致分析。