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【研究背景】紫外线（ultraviolet,UV）按照波长可分为UVA（320-400nm）、UVB（280-320nm）、UVC（100-280nm）3种,最后到达地面的UV主要是UVA和UVB。其中UVB可到达皮肤表皮的基底层,而UVA可穿透更深的皮肤,可到达真皮层。当皮肤长期暴露于UV下,UV可以通过对黑素细胞的直接作用以及刺激角质形成细胞释放黑素因子的间接作用促进皮肤黑色素生成。正常情况下,黑色素具有帮助皮肤吸收UV以及减轻光辐射对细胞DNA的直接损伤的功能,但其过速增长或分布不均会导致肤色不均、黄褐斑甚至皮肤癌等疾病,这对患者的生活、学习以及工作都造成极大的困扰。因此,美白和祛斑一直以来都是皮肤学科领域的研究热点之一。黑色素生成是一种复杂的合成过程,包括黑素细胞的增殖、黑色素的合成以及黑素小体向角质形成细胞的转移。特别是前两个步骤在黑色素合成中具有重要意义。当皮肤暴露在UV辐射下,角质形成细胞或黑素细胞会分泌各种重要的多肽、旁分泌细胞因子和自分泌细胞因子,在调节黑色素的产生具有重要作用。这些多肽和细胞因子包括α-黑素细胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH）及其受体黑素-1受体（melanocortin receptor 1,MC1R）、内皮素-1及其受体内皮素B受体、白细胞介素-2、碱性成纤维细胞生长因子、促肾上腺皮质激素等,这些物质通过不同的通路参与黑色素生成。其中α-MSH-MC1R通路的激活是UV引起的皮肤黑色素增加重要机制之一。MC1R主要在黑素细胞中表达,在调节哺乳动物皮肤和毛发颜色中起着关键作用。当受到UV刺激,角质形成细胞和黑素细胞分泌的α-MSH与MC1R结合,激活黑色素生成通路,最终增加了微量邻苯二甲酸相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor,MITF）的表达。MITF的激活可促进酪氨酸酶（tyrosinase）、酪氨酸酶相关蛋白酶（tyrosinase-related protein,TRP）1和2的合成,促进黑色素的合成。近年来,天然植物来源的抗氧化剂因其来源广泛、强大的抗氧化性等被广泛用于研究。有研究证明天然抗氧化剂可以通过直接或间接的途径激活Nrf2信号通路,诱导下游抗氧化酶及II相代谢酶的转录和表达,继而抑制tyrosinase活性,直接或间接抑制黑色素的合成。茶多酚（tea polyphenols,TPS）是黄酮类抗氧化剂,具有抗氧化、抗菌、抗辐射以及抗肿瘤等作用。TPS的成分中主要儿茶素为主,包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表儿茶素（EC）。TPS作为抗氧化剂也能激活Nrf2等抗氧化应激信号通路,清除H202和ROS,增强SOD、GSH-Px等的活性,对黑色素的生成有一定的抑制作用。已有少量研究证明TPS具有一定的抑制tyrosinase活性、减少黑色素生成作用,但目前没有文献报道TPS能否通过调控α-MSH-MC1R通路发挥抑制黑色素生成的作用,因此这是本实验的探究重点。在UV引起皮肤黑色素增加的机制中,α-MSH是关键因素,而阻断α-MSH-MC1R信号通路是减少黑色素的生成的重要环节。因此,本实验以TPS为实验对象,构建人永生化角质形成细胞（human immortalized keratinocytes,Ha Ca T）及人黑素细胞（Human epidermal melanocytes,HEM）为靶点,探讨TPS通过α-MSH-MC1R信号通路调控UVA引起黑色素增加的机制,从而为黑色素性疾病的干预和治疗提供可靠的科学依据。【目的】1.探讨TPS对α-MSH-MC1R信号通路的调控作用及其在UVA诱导黑色素生成的机制;2.探讨TPS对UVA诱导HEM细胞黑色素生成的调控作用。【方法】1.不同浓度TPS分别作用于Ha Ca T细胞和HEM细胞24h后,CCK-8法检测细胞增殖活性,筛选对细胞无毒性的TPS浓度。筛选UVA诱导HEM细胞黑色素生成的光照剂量,取生成黑色素效率最高的照射剂量作为后续光照方案。2.使用不同浓度的TPS、UVA以及α-MSH拮抗剂（Nonapeptide-1 acetate salt,N-1A）处理Ha Ca T细胞以及HEM细胞后,采用Na OH法检测HEM细胞的黑色素含量,左旋多巴（L-DOPA）为底物测定细胞内tyrosinase活性,ELISA检测Ha Ca T细胞和HEM细胞中α-MSH表达情况,Western Blot法检测HEM细胞中tyrosinase、MC1R、MITF、TRP-1、TRP-2等蛋白的表达。【结果】1.不同浓度TPS孵育Ha Ca T细胞和HEM细胞,CCK-8法检测显示,与对照组（0μg/m1）相比,5μg/m L、10μg/m L和15μg/m L TPS处理的Ha Ca T细胞和HEM细胞的相对生长率无明显变化（P均>0.05）。剂量为15 J/cm2的UVA处理HEM细胞生成的黑色素含量最高（P<0.05）。2.不同浓度的TPS（5μg/m L、10μg/m L和15μg/m LTPS）和15 J/cm2UVA处理HEM细胞和Ha Ca T细胞后,与对照组（0μg/m L TPS）相比,黑色素含量明显下降（P均<0.05）,tyrosinase活性受到明显抑制（P均<0.05）;ELISA检测结果显示Ha Ca T细胞和HEM细胞中α-MSH含量中明显低于对照组（0μg/m L TPS）（P均<0.05）;Western Blot结果显示,与对照组（0μg/m L TPS）相比,HEM细胞中tyrosinase、MITF、TRP1、TRP2等蛋白的表达明显下调（P均<0.05）。3.与单一使用N-1A或15μg/m LTPS相比,同时使用两者处理HEM细胞的黑色素含量明显减低（P均<0.05）,tyrosinase活性抑制更明显（P均<0.05）;单独N-1A处理的15 J/cm2UVA辐照下HEM细胞和Ha Ca T细胞显示两种细胞α-MSH水平与未予N-1A处理的细胞无明显差异（P均>0.05）,但同时使用N-1A和TPS处理细胞后,α-MSH水平出现明显降低（P均<0.05）。Western Blot结果显示N-1A处理HEM细胞后,可明显降低MC1R蛋白的表达（P<0.05）,而TPS处理后MC1R蛋白的表达无明显变化（P>0.05）。【结论】TPS可以通过α-MSH-MC1R信号通路抑制UVA诱导的黑色素生成。此外,TPS通过直接抑制α-MSH表达而不是下调MC1R蛋白水平来参与调控α-MSH-MC1R信号通路。