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目的:乳腺癌是导致女性癌症死亡的主要原因,据估计,2018年全球新增超过200万病例,乳腺癌占美国女性新增癌症病例的30%。许多证据表明基因的遗传变异与癌症密切相关,如单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）及其单倍体,包括肿瘤易感性和药物敏感性。与单个单核苷酸多态性的常规分析相比,包括2-3个SNP的多等位基因的关联分析显著提高了癌症易感性位点的检测。因此,研究多个SNP形成的单倍体,即连锁SNP与肿瘤的相关性以及潜在的分子机制有着重要的意义。mTOR基因位于染色体1q36.2。mTOR是决定肿瘤发生发展的中心调节器,在细胞增殖、迁移和多药耐药中发挥重要作用。位于mTOR基因启动子的SNP rs2295080（-141G/T）与各种癌症的风险增加有关。本文在研究mTOR启动子rs2295080的基础上,进一步研究是否与其他SNP连锁,导致不同SNP与肿瘤易感性和药物敏感性和预后的差异。研究方法:1研究人群2008年10月至2013年6月,从中国医科大学第一医院连续招募547名经组织病理学确诊为乳腺癌的女性患者和504名健康女性志愿者。问诊后,收集5ml外周静脉血进行进一步的单核苷酸多态性基因分型。临床数据来自随访的健康风险问卷和医疗记录。健康对照是从那些去同一家医院进行健康体检者,没有已知的疾病或遗传性疾病,也没有服用任何药物的人中招募的。受试者在被纳入正在进行的研究之前都给予了他们书面的知情同意。2 SNP基因分型从每个血液样本的白细胞中分离出基因组DNA。采用Taqman等位基因识别方法对所选单核苷酸多态性进行基因分型。利用ABI 7500快速实时PCR平台的Taqman单核苷酸多态性基因分型分析,用荧光染料HEX和FAM标记单核苷酸多态性特异性探针。3免疫组织化学将样品与一抗在4℃孵育过夜。免疫染色程度是由两位不了解实验条件的病理学家在光学显微镜下检查的。免疫反应强度评分如下:无染色0分,弱染色1分,中度染色2分,强染色3分。用5%的增量（0%,5%,10%,……100%）对染色细胞的百分比进行评分。最后的免疫反应评分是通过将强度评分乘以阳性细胞的百分比来确定的。4免疫印迹分析提取MCF7或MCF7/PTX细胞总蛋白并进行定量分析。用10%SDS-PAGE电泳法从每个细胞裂解液中分离出60μg蛋白质并转移到硝化纤维素膜上。一抗4℃过夜。在室温下孵育二抗1h,用ECL检测化学发光。5免疫荧光将MCF7细胞以5x104细胞/孔的密度接种在培养皿中。转染24h后,用4%（w/v）多聚甲醛在PBS中固定10分钟,一抗在4℃孵育过夜。用共聚焦激光扫描显微镜检测荧光。6细胞周期分析MCF7和MCF7/PTX细胞在6孔板中培养。转染后,于7.3nM紫杉醇（Paclitaxel,PTX）培养24h,收获细胞,将细胞密度调整为107个/ml。用流式细胞仪分析细胞周期。比较不同组S期细胞的百分比。实验重复3次。7体内裸鼠移植瘤实验在BALB/C裸鼠的肩胛部皮下注射MCF7细胞制备移植瘤模型。细胞注射10天后,每隔3天测量一次肿瘤,同时,PTX在第一次通过尾静脉注射,治疗组为单用PTX、pcmTOR-Ht1和pcmTOR-Ht2,每三天一次,共6次。同时建立NC组（n=5）。观察了对异种移植瘤小鼠体重和体内肿瘤生长的影响。在20天、26天和32天的PTX注射后4h收集血浆。处死小鼠,称重,进行组织学检查,并通过UPLC-MS/MS测定血浆PTX浓度和瘤体细胞内的PTX浓度。8质谱分析对肿瘤组织进行称重,高速匀浆。细胞在6孔板中培养。转染pcmTOR-Ht1、pcmTOR-Ht2和NC。24h后,用7.3nM PTX培养24h,然后反复冻融使细胞溶解。10000×g离心5分钟后,收集上清液进行UPLC-MS/MS分析。9荧光素酶报告分析将细胞转移到96孔板。将pGL3-Ht1、pGL3-Ht2和pRL-TK质粒导入293T或MCF7细胞。使用双荧光素酶报告分析系统测量Fluc活性。并用Rluc荧光素酶活性校正了荧光素酶活性的值。相对荧光素酶活性通过阴性对照进行归一化分析。实验重复3次,每次包括3个生物学重复。10融合蛋白-NLuc荧光素酶活性检测pNLuc-ZEB1和pNLuc-KLF5可以产生NLuc融合蛋白。将pGL3-Ht1、pGL3-Ht2、pNLuc-ZEB1和pNLuc-KLF5质粒以1μg/ml的浓度进行转染。在以下时间采集细胞:4、8、12、16、20和24h,检测荧光素酶活性。11免疫共沉淀质粒pcmTOR-Ht1,pcmTOR-Ht2被转染到MCF7细胞。收集样品,用ZEB1抗体和KLF5抗体在4℃下免疫沉淀过夜。DNA片段用基因组DNA提取试剂盒纯化,用于qRT-PCR分析,并测序鉴定。结果:1 mTOR启动子区单倍体与肿瘤易感性、药物敏感性和预后相关我们发现rs2295080（-141G/T）和rs2295079（-78C/G）构成连锁单倍体,其中以Ht1（78C/-141G）和Ht2（-78G/-141T）为主。携带Ht2的患者与乳腺癌易感性增加显著相关（校正后OR（95%CI）:1.339（1.096-1.637）,P=0.004）。Ht1和Ht2的分布频率与肿瘤大小（P=0.019）、临床分期（P=0.004）和淋巴结转移状态（P=0.015）显著相关。多变量Cox回归分析重复并证实单倍体（Ht2与Ht1）是乳腺癌患者OS和DFS的独立预后指标,Ht2与相对较短的OS（p=0.008,校正HR（95%CI）:2.535（2.339-3.847））和DFS（p=0.010,2.224（2.072-3.695））。2 mTOR单倍体与乳腺癌患者组织中mTOR的表达相关mTOR启动子区Ht2基因型的患者与mTOR的高表达相关,通过对接受新辅助化疗的乳腺癌患者的研究发现,mTOR启动子区Ht2基因型的患者与乳腺癌的不良预后相关。3 mTOR单倍体对乳腺癌细胞生物学行为的影响转染pcmTOR-Ht2后,MCF7细胞中的增殖作用明显高于pcmTOR-Ht1,而在MCF7/PTX细胞中则不明显;MCF7细胞转染pcmTOR-Ht2后,PTX-IC50从4.17nM（NC）显著增加到61.61 nM,但在MCF7/PTX细胞中没有显著差异（P>0.05）。转染pcmTOR-Ht2后,MCF7细胞内PTX浓度明显降低,并且细胞S期的百分比显著升高,但MCF7/PTX细胞没有显著差异。4 mTOR单倍体对荷瘤小鼠乳腺癌生长及化疗抵抗的影响IHC分析显示,Ht2过度表达的肿瘤中p-mTOR、mTOR、ABCB1和CCND1的水平远高于Ht1。与pcmTOR-Ht1+PTX和NC+PTX组相比,pcmTOR-Ht2+PTX组的细胞PTX浓度显著降低。但各组血浆样品的PTX浓度无显著差异。上述数据表明,与Ht1相比,Ht2高表达mTOR,从而在体内促进肿瘤生长,并影响PTX的敏感性。5转录因子与不同单倍体差异结合分析荧光素酶活性测定表明,在293T和MCF7细胞中,Ht2组的转录活性明显高于Ht1组（P<0.0001）。进一步实验证实,KLF5可降低pGL3-Ht1的转录活性（p<0.0001）。这表明KLF5是一个特异性转录调控抑制因子。相比之下,ZEB1可促进pGL3-Ht2的转录活性（p<0.0001）,表明ZEB1是一种特异性转录调控促进因子。6 KLF5和ZEB1通过mTOR表达差异影响乳腺癌细胞增殖和药物敏感性与转染pcmTOR-Ht1相比,转染Ht2的乳腺癌细胞中p-mTOR,mTOR,ABCB1和CCND1表达增加。总之,转录因子可与mTOR启动子特定序列结合,转录因子ZEB1可促进mTOR转录,而KLF5可抑制mTOR转录。结论:本实验基于单倍体的病例对照研究,对mTOR基因5’UTR中的单核苷酸多态性进行了基因分型和鉴定。我们发现rs2295080（-141G/T）和rs2295079（-78C/G）构成连锁单倍体,其中以Ht1（78C/-141G）和Ht2（-78G/-141T）为主,与乳腺癌的易感性、PTX药物敏感性和临床预后有关。我们进一步发现,Ht1和Ht2对mTOR基因转录活性存在差异,Ht2的-141T等位基因可与转录因子ZEB1结合,而Ht1的-78C等位基因能够与KLF5转录因子特异结合,影响mTOR表达,进而影响乳腺癌的易感性、PTX药物敏感性和临床预后。因此,ZEB1和KLF5通过与mTOR单倍体等位基因差异结合来调控mTOR转录,从而通过ZEB1/KLF5-mTOR-CCND1/ABCB1信号通路抑制或促进mTOR基因的表达、进一步影响细胞增殖和细胞毒性药物的外排,从而影响PTX的药物敏感性和预后。