背景目前中晚期胃癌的治疗主要以减轻症状、缓解病情为主,而难以达到根治的目的。治疗方法包括手术治疗、放疗和化疗,而化疗由于兼顾局部与全身的特点,在晚期胃癌的综合治疗中占有重要地位。然而,随着大量化学药物的使用,多药耐药性也随之而来,据美国癌症协会统计,每年死亡的49万例癌症患者中,90%以上与多药耐药有关。所谓多药耐药(multidrug resistance,MDR),指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他结构不同、作用机理不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药性的现象。长期以来,肿瘤的MDR现象是肿瘤化疗过程中的一个棘手问题,也是肿瘤治疗的一大障碍,认识肿瘤的多药耐药机制,寻找高效的耐药逆转剂,有重大的临床意义。肿瘤多药耐药机制非常复杂,已有研究报道,药物外排、药物失活、DNA损伤、细胞凋亡和生存信号途径改变是引起肿瘤耐药的主要机制。在胃癌研究中,参与胃癌耐药的调控因子有多种,其中主要表现为非编码RNA、转录因子、多药耐药相关分子等的调控。尽管部分胃癌耐药性的分子机制已经被研究,然而由于胃癌耐药性本身的复杂性及已有研究的局限性,现有的研究无法满足临床的需求,因此,深入研究胃癌耐药性产生的分子机制具有重要意义。目前中医认为,胃癌术后化疗后发生转移的病理因素,脾虚发病为内在因素,湿滞是其病理产物,又是治病病因,在脾虚的同时加重湿滞,胃癌术后化疗后有脾虚湿滞症患者应尤为重点预防转移。薏苡仁是治疗脾虚湿滞症的首选药。薏苡仁油注射液是一种以薏苡仁为主要原材料的中药注射剂,其有效成分为薏苡仁酯及薏苡仁素,该物质具有多种对抗肿瘤的作用机制,在免疫调节、降血糖、诱发排卵及抗肿瘤方面发挥重要作用。已有研究报道薏苡仁油注射液对多种肿瘤,包括肺癌、胰腺癌、肝癌及胃癌的治疗均有显著效果,同时,薏苡仁油注射液在抑制肿瘤生长的同时,还可加强肿瘤耐药的敏感性。胃癌研究中,有报道称化疗治疗结合薏苡仁油注射液对胃癌治疗具有较好的效果;同时,薏苡仁油注射液具有抑制胃癌多药耐药相关基因表达的作用。然而,薏苡仁油注射液在胃癌耐药性的分子机制中所发挥的作用还有待研究。长链非编码RNA作为非编码RNA的一种,广泛存在于哺乳动物体内。LncRNA虽然不具备编码蛋白质的功能,但其通过调控蛋白质的表达进而参与到生命体的生长、分化、增殖和凋亡等过程。大量研究表明,LncRNA在转录、转录后及表观遗传水平调控肿瘤相关通路,同时有研究表明:几乎所有的肿瘤中,都存在LncRNA表达异常。因此,lncRNA正逐渐成为研究肿瘤致病机制中的一个重要因子。LncRNA由于其本身的不保守性,它不只是参与到生命活动的各个进程,同时还调节着肿瘤耐药性及药物敏感性。已有研究证实多种LncRNA通过提高DNA修复功能,改变药物代谢和跨膜外排,调节细胞凋亡率以及影响上皮-间充质进程而改变细胞的耐药性。PVT1作为LncRNA的一种,其位于原癌基因MYC启动子上游60 kb处。有研究表明PVT1的过表达具有促癌作用,其在促进癌细胞增殖和侵袭的同时,还增强了肿瘤细胞对化疗的耐药性,相关研究已经在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌中得到证实。在胃癌中,PVT1的表达也显著上调,然而其对胃癌耐药性的影响暂无报道。因此,本研究首先在胃癌耐药组织和细胞中,利用qPCR检测了 PVT1的表达;然后通过调控PVT1的表达,观察其对胃癌耐药细胞中耐药相关蛋白的影响;随后利用薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株,观察PVT1的表达变化;最后通过调控胃癌耐药细胞中PVT1的表达并利用薏苡仁油注射液处理后,观察胃癌耐药相关蛋白的表达变化。最终阐明PVT1在胃癌耐药性中所扮演的角色及其发挥功能的分子机制。本研究为深入阐明胃癌耐药性的分子机制提供了依据,同时为胃癌耐药性的治疗提供了理论基础。研究内容分为4部分:1.LncRNA-PVT1对胃癌细胞耐药性的影响目的:分析胃癌耐药性患者肿瘤组织和胃癌耐药细胞株中PVT1的表达情况,并进一步在体外观察PVT1过表达或表达抑制对胃癌细胞耐药性的影响。方法:首先分离顺铂耐药性和顺铂敏感性胃癌患者肿瘤组织,利用qPCR检测两组样本中PVT1的表达量;而后利用qPCR测定胃癌耐药细胞株BGC823/DDP和SGC7901/DDP中PVT1的表达量。BGC823/DDP和SGC7901/DDP细胞株分别转染干扰序列si-PVT1后,利用qPCR测定PVT1的表达量;随后利用11μg/ml的顺铂分别处理细胞株24 h、36 h和48 h后,CCK-8检测细胞的存活率。BGC823和SGC7901分别转染过表达载体LV-PVT1-GFP后,利用qPCR测定PVT1的表达量;随后再利用1 μg/ml的顺铂处理细胞株48 h后,流式细胞术结合Annexin V-PI法测定细胞的凋亡率结果:胃癌耐药性患者肿瘤组织和胃癌耐药细胞株(BGC823/DDP和SGC7901/DDP)中PVT1的表达量显著上调;PVT1干扰序列显著降低了胃癌耐药细胞株中PVT1的表达;胃癌耐药细胞转染si-PVT1并用顺铂处理后,显著降低了胃癌耐药细胞的存活率,并增加了其凋亡率;胃癌细胞株BGC823和SGC7901转染LV-PVT1-GFP并利用顺铂处理后,显著增加了胃癌细胞株中PVT1的表达,并抑制了细胞的凋亡率。结论:胃癌耐药性患者肿瘤组织及胃癌耐药细胞株中,PVT1的表达上调;过表达PVT1,增加了胃癌细胞株对顺铂的耐药性;抑制PVT1的表达,增加了胃癌细胞株对顺铂的敏感性。2.PVT1增加胃癌细胞耐药性的分子机制研究目的:体外过表达PVT1,检测顺铂处理后的胃癌细胞多药耐药性相关分子MDR-1、MRP1、mTOR和HIF-1α的表达变化,旨在探讨PVT1促进胃癌细胞耐药性的分子机制。方法:构建PVT1过表达载体LV-PVT1-GFP转染胃癌细胞BGC823和SGC7901,并用顺铂处理48h后,利用qPCR检测MDR-1、MRP1、mTOR和HIF-1α的mRNA的表达量;利用western blotting检测MDR-1和MRP1的蛋白表达量。结果:PVT1过表达显著增加了经顺铂处理的胃癌细胞株中MDR-1和MRP1的表达,而mTOR和HIF-1α的表达量不受PVT1的调控。结论:PVT1调控胃癌细胞对顺铂的耐药性极有可能是通过调控MDR1及MRP1的表达而实现的,而mTOR和HIFα的表达却不受PVT1的调控而参与胃癌耐药性机制。3.薏苡仁油注射液对胃癌细胞耐药性的影响目的:采用不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,旨在探讨薏苡仁油注射液对胃癌细胞耐药性的影响。方法:选取胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,用浓度梯度不同的薏苡仁油注射液(1、2.5、5μl/ml)分别处理24、36、48h,利用CCK-8检测细胞活力;薏苡仁油注射液处理48 h后,流式细胞术结合Annexin V-PI法检测细胞凋亡情况;利用qPCR检测MDR1和MRP1的mRNA的表达量;利用western blotting测定MDR1和MRP1蛋白表达量。结果:利用不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP一段时间后,结果显示:同一时间点,随着薏苡仁油注射液浓度的增加,细胞活力显著降低,而其凋亡率显著升高;同一浓度的薏苡仁油注射液,随着处理时间的增加,细胞活力显著下降,而其凋亡率显著升高。随后我们检测了不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药株细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP 24 h和48 h后,MDR1和MRP1的表达量。结果显示:无论处理时间是24 h还是48 h,MDR1和MRP1的表达都随着处理浓度的增加而显著降低,呈剂量依赖性。结论:薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株促进了细胞的凋亡而抑制了其活性,同时降低了 MDR1和MRP1的表达。即表明:薏苡仁油注射液处理显著降低了胃癌细胞对顺铂的耐药性。4.薏苡仁油注射液抑制胃癌细胞耐药性的分子机制研究目的:体外过表达PVT1,检测薏苡仁油注射液处理后胃癌耐药细胞株多药耐药性相关分子MDR1、MRP1的表达,旨在探讨薏苡仁油注射液抑制胃癌细胞耐药性的分子机制。方法:不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞株BGC823/DDP和SGC7901/DDP 24 h后,qPCR检测PVT1的表达。PVT1高表达慢病毒转染胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP后,再利用2.5μl/ml浓度薏苡仁油注射液处理。流式细胞术检测细胞凋亡率;qPCR 检测 MDR1 和 MRP1 的 mRNA 表达量;western blotting 检测 MDR1 和 MRP1的蛋白表达量。结果:不同浓度薏苡仁油注射液处理胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP后,PVT1的表达随着薏苡仁油注射液浓度的增加而显著降低;PVT1高表达慢病毒转染胃癌耐药细胞BGC823/DDP和SGC7901/DDP,并用薏苡仁油注射液处理后,显著抑制了细胞的凋亡率,同时显著上调了 MDR1和MRP1的表达。结论:薏苡仁油注射液通过抑制PVT1降低多药耐药性相关分子MDR1和MRP1的表达进而抑制了胃癌细胞耐药性。综上所述,本文深入探讨了 PVT1对胃癌耐药性的影响,在明确胃癌耐药组织及细胞中PVT1的表达显著上调的基础上,部分揭示了 PVT1参与胃癌耐药性的机制。同时,PVT1调控胃癌细胞耐药性机制可能是通过调控MDR1及MRP1的表达而实现的。薏苡仁油注射液处理显著降低了胃癌细胞的耐药性,其具体分子机制是通过抑制PVT1的表达,降低多药耐药相关分子MDR1和MRP1的表达,从而降低胃癌细胞耐药性。