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猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列入OIE疾病名录（OIE Listed diseases），为须申报的（notifiable）动物传染病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化，在临床表现上趋于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患。CSFV跟同属的牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2型（BVDV-2）、绵羊边界病病毒（BDV）和长颈鹿瘟病毒（Pestivirus of giraffe）都属于是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员，由于瘟病毒属其它成员大都可以感染猪，与CSFV存在血清学交叉反应，因此给猪瘟诊断造成一定干扰。此外，猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）在我国的大规模应用，为控制猪瘟起到了重要作用，但同时也给传统的诊断方法对CSFV野毒感染猪和疫苗接种猪的鉴别诊断带来较大困难。本研究旨在建立一种复合荧光定量RT-PCR方法，用于CSFV野毒株与兔化弱毒疫苗株的鉴别诊断。通过对GenBank中公布的34株CSFV野毒和弱毒疫苗株基因组序列的比较分析，在其5′端非编码区设计了一对针对CSFV的通用引物和两条分别针对不同基因亚群的CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株的敏感、特异、重复性好的复合荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群（1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群）的CSFV野毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，在106-101拷贝／μL范围内，对CSFV野毒和兔化弱毒疫苗标准品模板的检测具有良好的线性关系，分别可检测到初始模板中41.8个（野毒）或81.5个（弱毒）拷贝的病毒RNA，与本实验室建立的复合RT-套式PCR（RT-nPCR）的敏感性相近，二者对152份不同样品（包括细胞培养物和临床现地样品）检测阳性符合率分别为96.2％（野毒）和100％（兔化弱毒疫苗）。应用复合荧光定量RT-PCR对其中106份现地样品检测发现，野毒阳性率为30.2％（32／106）。应用本方法对人工感染106TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0～14d全血中CSFV RNA进行了定量检测，揭示了CSFV在猪体内复制的动态变化，同时发现，人工感染猪在感染后第2天在其全血中就可检测到病毒RNA，而同居感染猪在出现猪瘟临床症状前3～4d可从其全血中检出病毒RNA。应用本方法对8份猪瘟兔化细胞疫苗原液效价的检测，证实本方法与兔体反应热法在疫苗效价测定上具有良好的相关性，初步确定细胞疫苗样品中病毒RNA的含量为2.23×107拷贝／mL(相当于5×104RID50)以上时才可以用于制苗。本方法可以及早对猪瘟爆发做出准确快速诊断，防止疫情蔓延；可以将CSFV野毒感染猪迅速从免疫猪群中筛查出来并予以清除，有利于猪瘟的净化和无猪瘟疫区的建立；同时本方法还可辅助传统的兔体定型热反应用于猪瘟疫苗效价估测、CSFV致病机制研究以及猪瘟疫苗免疫攻毒保护效力评价。