噬菌体抗体库技术是近十年来发展起来的一项新技术，但由于早期的抗体库库容量有限，它的应用仅限于筛选已知抗原的抗体，而且建库的原始材料一般是用某种抗原免疫过的小鼠脾脏。这就使其应用受到了很大的限制，这也是人们一开始对它过高期望之后失望的原因。后来随着建库技术的不断提高，大库容量抗体库（>10⁸）的构建已不再是可望不可及的事情了，人们又重新开始关注这一技术的发展、应用了。由于库容量的提高，就可以不经免疫构建天然抗体库了，这为制备人源性抗体开辟了一条新途径。后来细胞内重组技术在抗体库构建中的应用使得库容量的提高飞跃到一个前所未有的水平。这就使从大库容量的抗体库中筛选未知抗原的抗体成为可能。但问题依然存在，这就是重组之后只有1／4的重组体是正确的抗体，也就是说，抗体库存在被污染问题。这就会对以后的筛选带来意想不到的麻烦。意大利学者Bradbury将细胞内重组技术进一步改进，不仅解决了抗体库的污染问题，而且，在抗体库的扩增和筛选过程中不仅保证了库多样性的不丢失，而且使抗体库在筛选的同时进行了链更替，即亲和力成熟过程，这使得所筛出的抗体的亲和力更高。 本课题采用了Bradbuy的方法构建了8x10¹¹的肝癌单链抗体库。实验方法和结果如下： 从200多位原发性肝癌患者的约400ml外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA（1.0mg），分离纯化mRNA（12μg），反转录出cDNA第一链，用针对抗体可变区第一和第四框架区的引物扩增可变区基因。将PCR产物混合后，进行第二轮PCR，第二轮PCR的退火部位是第一轮PCR引物所共同含有的保护序列。将第二轮PCR的 第 四 军 医 大 学 博 士 学 位 论 文 产物首先克隆入T载体，建立了重链和轻链在T载体中的克隆文 库，其中重链库的库容为3．85门，轻链库的库容为2．30X10二然 后再依次将轻链库和重链库分别克隆入具有重组功能的噬粒表达 载体pDANS。用辅助性噬菌体进行噬菌体挽救后用初级噬菌体抗 体库感染BS1365细菌使不同单链抗体的重链和轻链在同一个细菌 内发生重组、互换，用辅助性噬菌体挽救后产生的抗体库即为次 级抗体库。我们构建的次级库的库容量是 sxlo’‘。 不同于一般的基因克隆、表达的是，抗体库的构建要求每一个 环节都需要有很高的效率。因而在构建抗体库之前，有必要做一 系列预实验来确定并设法提高每一个环节的效率。主要是各种限 制性内切酶的酶切效率、PCR产物的克隆效率、转化效率。这儿 个环节是影响大库容量抗体库构建的几个关键限制步骤。山于 PCR产物的酶切效率低，所以直接将PCR产物酶切后克隆入表达 载体的效率是非常低的。为解决这一问题，我们采取了先将PCR 产物克隆入T载体，然后再从T载体中切下来克隆入表达载体的 措施。这一方法上的改进使PCR产物的克隆效率提高了20倍之多， 从而使建库的工作量大大降低。 通过筛选得到的单链抗体的亲和力是与抗体库的库容量成正 比的。川O的抗体库可以产生10SM水平的抗体，而人们现正在致 力于构建的库容量达川二的抗体库预计可产生亲和力达10“’OM的 抗体。遗憾的是，山于时问紧张，我们没有对所构建的抗体库进 行筛选，但从库容量估计，从该抗体库中应该能筛选到高亲和力 的肝癌特异性或相关性抗体。