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人类疾病动物模型是指生物医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物,是基础和临床研究的纽带。通过构建疾病动物模型研究基因的功能进而揭示疾病发生的机制,有助于药物筛选和药效评价的开展以及疾病诊断技术和治疗手段的发展等。人类疾病动物模型在医学研究领域里发挥着重大作用。人类墨蝶呤还原酶缺乏症是SPR基因突变导致的一种常染色体隐性遗传病。该病在新生儿遗传病筛查中不易被发现且易被误诊为其它疾病,从而错失最佳治疗时间。此外,临床上对该疾病的治疗手段过于单一,无法完全满足病患个体多样性的治疗需求,为该疾病的临床发现和治疗带来了极大困难。因此对人类墨蝶呤还原酶缺乏症仍需进行深入研究,以期发现便于确诊的新指标和开发出更广谱、高效的药物。家蚕具有遗传背景清晰、体型适中、易于饲养、生命周期短、繁殖率高等优点,其与人类基因组同源率达58%,且有许多人类疾病相关的同源基因,因此家蚕具有作为人类疾病动物模型的潜力。本研究以家蚕lem突变体为研究对象,探究其能否作为人类墨蝶呤还原酶缺乏症的动物模型。取得的研究结果如下:1.墨蝶呤还原酶缺乏症致病基因SPR的系统发生分析为了解SPR基因在人类和常见模式动物间的保守性,我们对SPR基因进行系统发生分析。在NCBI上下载了人类、猕猴、小鼠、热带爪蟾、斑马鱼、果蝇、蜜蜂、埃及伊蚊、棉铃虫、赤拟谷盗和家蚕等物种SPR基因的蛋白序列,利用MEGA5.0软件构建系统发生树,通过分析发现,SPR基因在不同的进化阶层中相对保守,家蚕与冬尺蛾SPR基因的保守性最高。2.家蚕lem突变体BmSPR基因的克隆和相关基因表达分析调查人类墨蝶呤还原酶缺乏症是由于SPR基因突变导致。我们通过分子克隆实验发现家蚕lem突变体的BmSPR基因发生点突变,T碱基突变成A碱基,导致翻译提前终止,编码的碳端缺失5个氨基酸。这与人类墨蝶呤还原酶缺乏症的致病基因一致。为了解BmSPR基因的表达特征,我们调查了家蚕lem突变体中该基因的时期表达谱,结果显示BmSPR基因在家蚕lem突变体和野生型大造幼虫各个时期(从蚁蚕到5龄1天)均有表达。其中,在2龄1天的表达水平高于其它时期,且在突变体中显著高于大造中的表达水平,这说明BmSPR基因在家蚕幼虫早期可能具有更为重要的作用,与人类墨蝶呤还原酶缺乏症多在婴儿期发病一致。我们还调查了家蚕lem突变体在幼虫早期时BH4通路相关基因(BmGTPCH I、BmPTPS、BmDHFR、BmPAH和BmTH)的表达情况。结果显示当BmSPR基因突变时,这5个基因表达量的变化符合BmSPR基因突变时的表达趋势,也验证了BH4通路在家蚕和人类中的保守性。3.家蚕lem突变体作为墨蝶呤还原酶缺乏症模型的表型调查构建疾病动物模型时需考虑选用的动物模型是否有易于观察的表型。家蚕lem突变体幼虫呈黄体色。我们对遗传背景不同的另外8个具有lem表型的家蚕品系的BmSPR基因克隆,发现所调查的9个家蚕品系的BmSPR基因都发生了相同的点突变,因此我们可初步认为家蚕lem突变体的黄体色和BmSPR基因有对应关系。这种表型特征可能有助于家蚕lem突变体作为人类墨蝶呤还原酶缺乏症模型的运用。人类墨蝶呤还原酶缺乏症的临床表征有发育迟缓、运动障碍、肌张力障碍等。因此我们调查家蚕lem突变体和野生型大造的体重和体长,发现家蚕lem突变体比大造重,也比大造长,初步说明BmSPR基因突变对家蚕lem突变体的体重和体长没有负影响。我们还发现家蚕lem突变体的血糖水平和大造中的无显著差异。因此可初步判定BmSPR基因在家蚕中对发育的调控作用不明显。通过桑叶诱导实验和翻转实验探究BmSPR基因对家蚕lem突变体行动能力的影响,发现家蚕lem突变体组爬到桑叶处所需时间明显少于大造组,而且两组蚕所需的翻转时间无显著差异,这说明BmSPR基因突变对家蚕lem突变体的行动能力没有负影响。4.家蚕lem突变体作为墨蝶呤还原酶缺乏症模型的生化特征测评人类墨蝶呤还原酶缺乏症的显著特点之一就是不具有高苯丙氨酸血症。通过检测家蚕lem突变体和野生型大造血液中苯丙氨酸含量,发现家蚕lem突变体的血苯丙氨酸含量和大造中的无显著差异,这与人类墨蝶呤还原酶缺乏症的表现一致。人类墨蝶呤还原酶缺乏症患者的脑脊液中多巴胺和5-羟色胺含量显著降低,这是临床诊断的重要检测指标之一。利用UPLC技术检测这两种神经递质在家蚕lem突变体和大造头中的含量,发现与大造相比,家蚕lem突变体中多巴胺和5-羟色胺的含量显著降低,这与人类墨蝶呤还原酶缺乏症的生化表现一致。人类墨蝶呤还原酶缺乏症患者的新喋呤水平升高。通过UPLC技术检测家蚕lem突变体和野生型大造头中新喋呤含量,发现家蚕lem突变体中新喋呤的含量显著高于大造,这与人类墨蝶呤还原酶缺乏症的生化表现一致。5.添食多巴后家蚕lem突变体中多巴胺水平变化与墨蝶呤还原酶缺乏症治疗效果一致左旋多巴和卡比多巴联合用药是临床上人类墨蝶呤还原酶缺乏症确诊后的主要疗法,因此通过给家蚕lem突变体添食左旋多巴和卡比多巴来模拟该疾病的治疗。实验结果显示实验组头中多巴胺含量显著高于对照组,这与人类墨蝶呤还原酶缺乏症治疗过程中的生化水平变化一致。但目前尚未发现明显的表型变化。综上所述,依据目前已有实验结果,我们初步判定家蚕lem突变体在分子和生化水平的特征符合作为人类墨蝶呤还原酶缺乏症模型的要求。家蚕lem突变体可以作为研究人类墨蝶呤还原酶缺乏症及其新药开发的实验动物候选。