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近30年来,有害藻华发生次数、强度、分布地域都不断增加,这引发了公众健康问题并造成巨大经济损失。监测有害藻的动态变化对预测有害藻华爆发及其对人类与生态系统的风险有着重要意义。然而基于形态学的传统镜检方法耗时耗力,且很难区分一些形态极其相近的物种和毒素分布。因而采取分子生物学方法作为互补手段,以确保快速和可靠的物种鉴定。欧盟第七框架计划资助的MIDTAL(有毒藻类检测芯片)微阵列以rRNA基因(SSU和LSU)作为目标基因鉴定有毒藻。
本研究利用MIDTAL项目已验证特异性探针,结合厦门海域有害浮游植物种属特点,设计了适用于厦门海域有毒藻检测的寡核苷酸芯片。在厦门西港、九龙江口、厦门外港共设置3个站位,从2012年5月至2013年4月1周年共采集66个样品,对样品进行传统镜检,实时定量PCR,基因芯片3种方法检测与比较分析。
主要结果如下:
1)本研究共镜检出浮游植物106种,其中有害藻60种,11种具有潜在产毒素的能力。硅藻检出25属61种,占总种数的57.4%;甲藻9属27种,占总种数的25.47%;绿藻6属10种,占总种数的9.43%;蓝藻5属6种,占5.66%;着色鞭毛藻门2属2种1.80%。圆筛藻属、角毛藻属、骨条藻属为厦门港的常年优势类群,其细胞数影响着整个群落的细胞数量,在一定程度上左右了该海区浮游植物的时空分布。
2)通过传统镜检计数与实时定量PCR定量结果比较验证芯片探针信号,芯片不仅能有效检测出厦门港主要6大类群的有毒藻(Dinophysis,Karenia,Alexandrium,Prococemtrum,Pseudonitzschia,Heterosigmaakashiwo),而且检出了镜检未检出的类群(Pseudochattonella,Prymnesiophyta,Karlodiniumveneficum)。芯片共检测到21个种/亚种潜在产毒藻,而传统镜检仅检出11种,这意味着芯片对低细胞密度藻的检测更为灵敏。
3)用镜检数据对鳍藻属探针DphyGS03_25_dT,Alexandrium属探针AlexGD01_25_dT的芯片信号进行校准,相关校准曲线分别为y=45.441x-0.6298,R2=0.9477;y=0.0013x-0.2453,R2=0.5380(x为探针信号值,y为细胞数)。利用实时定量PCR结果校准米氏凯伦藻的种探针KmikiD01_25_dT的芯片检测信号,获得校准曲线y=94.562x-6.0238,R2=0.9948,结果表明芯片可用于有害藻的半定量分析。
4)应用校准曲线将相应探针信号换算成细胞密度,获得Dinophysis,Alexandrium,Kareniamikimotoi周年变化曲线,细胞浓度在2-3月份与6-7月份达到高峰,而9月份开始到来年1月份基本没有检山。说明春季与夏季早期均为有害藻潜在爆发期,尤其是亚历山大藻。
综上所述,本研究设计的寡核苷酸芯片可适用于厦门海域有毒藻动态高通量快速检测分析。