研究背景创伤性脑损伤(Traumaticbraininjury,TBI)是由直接和间接外力引起的大脑严重受损的疾病,疾病多发于年轻患者,绝大部分的幸存者有不同程度的身体、心理和神经功能障碍,具有高发病率、致残率和高死亡率等特性,会使家庭和社会精神及经济负担过重。但是现在,治疗创伤性脑损伤是有限的,因此进一步研究创伤性脑损伤后的生理和病理变化的机制,寻找新的有效的治疗靶点一直在创伤性脑损伤的研究热点和难点。二次脑损伤发生在受伤的几分钟后几天或更长时间,因此二次脑损伤的治疗是改善脑外伤患者的预后的关键。最近的研究表明,氧自由基造成的创伤性脑损伤后,特别是超氧阴离子的连锁反应是受损的神经元病理环节的核心。主要损伤的基础上,因为血管组织局部缺血,缺氧,缺血再灌注和出血等,可以产生大量的有毒的氧自由基,如脂质过氧化(LPO),过氧化氢和O2-,OH-,等。由于自由基的性质活泼,自由基氧化应激和级联,不断形成新的自由基或活性氧代谢产物。会导致蛋白质氧化,脂质氧化,细胞核溶解,呼吸链中断,细胞凋亡等。因此,寻找选择性和氧自由基和抑制脂质过氧化作用的药物是正确治疗自由基损伤的主要方法。当前,氢气抗氧化作用的研究日益成为国内外学者关注的焦点,氢气是一种无色、无嗅、无味的双原子气体。近年来文献报道,氢并不是生理惰性气体,而是理想的抗氧化剂,选择性抗氧化作用可以中和有害的自由基,保护细胞DNA,蛋白质等,不破坏线粒体并保持正常功能,防止细胞凋亡。为进一步探讨氢气在脑损伤中的治疗作用,本研究采用自制富氢生理盐水干预大鼠颅脑损伤模型,脑损伤后连续7d进行腹腔注射,通过行为学,组织病理学及分子生物学等多方面探讨富氢生理盐水对脑损伤的保护作用机制,为进一步研究富氢生理盐水在脑损伤中神经保护作用寻找理论依据。第一部分 富氢生理盐水对大鼠创伤性脑损伤行为学的影响目的观察富氢生理盐水对大鼠模型运动功能及学习记忆的影响方法采用改良Feeney法,建立大鼠创伤性脑损伤模型,分别为：假手术组(sham组)、脑损伤组(TBI组)、脑损伤富氢生理盐水治疗组(HS组)。sham组术后一般饮食；TBI组每只大鼠10ml/kg/d给予生理盐水腹腔内注射；HS组每只大鼠10ml/kg/d给予富氢生理盐水腹腔内注射,TBI组和HS组连续注射7d,术后分六次(1、3、7、14、21、28d) mNSS神经功能评分对神经功能损伤进行行为学评定、平衡木平衡实验及行走实验来检测3组大鼠的平衡及运动协调能力,并在术后10-14d,24-28d采用水迷宫检验大鼠学习记忆能力。结果从一般行为学观察发现TBI组及HS组大鼠,在脑损伤早期,大鼠模型进食量,饮水量均减少,后期恢复与sham组相同,重复测量检验结果显示差异无统计学意义(F[foodintake]=3.256, F[waterintake]=10.256, P>0.05); TBI组大鼠在术后体重最低,HS组大鼠体重其次,sham组大鼠体重变化不大,体重方差分析显示差异有统计学意义(F=12.680, P<0.05)。mNSS评分显示28dsham组评分为1.80±±0.45、TBI组评分为8.96±1.25、HS组评分为4.56±2.00,秩和检验结果发现差别有统计学意义(χ2=24.65,P<0.05)。重复测量方差分析发现TBI组大鼠平衡木平衡时间短于sham组及HS组(F=23.86,P<0.05),但是富氢组(HS组)与生理盐水组(TBI组)之间差别无统计学意义(F=3.42,P>0.05)；TBI组大鼠平衡木行走时间长于sham组及HS组(F=10.55,P<0.05),HS组行走时间也长于sham组(F=5.72,P<0.05)。水迷宫检测发现随着训练时间不断增加,在两个不同阶段发现三组大鼠的潜伏期却在逐渐缩短,但与sham组(sham组)及HS组(HS组)相比,TBI组(TBI组)时间延长(F=9.80, P<0.05), sham组与HS相比差异无统计学意义(F=2.27,P>0.05)。在14d时sham组目标象限所占时间为42.3±4.55%,TBI组为35.6±8.34%,HS组为36.7±7.65%,统计学分析显示差异无统计学意义(F=2.27,P>0.05)；28d探索试验中sham组目标象限所占时间为65.6±±6.80%,TBI组为45.7±±5.27%,HS组(HS组)为56.1±7.00%,统计学分析差别有统计学意义(F=13.57,P<0.05)；TBI组(TBI组)大鼠能够穿过平台次数3组中最少,与其他两组sham组(sham组)及HS组(HS组)对比,差异无统计学意义(F=7.05,P>0.05)。结论经过富氢生理盐水治疗,可以有效促进创伤性脑损伤大鼠体重恢复,通过修复大鼠神经功能障碍,改善运动功能及学习记忆能力。第二部分 富氢生理盐水对大鼠创伤性脑损伤病理学的治疗作用目的观察富氢生理盐水对大鼠创伤性脑损伤范围,脑水肿和血脑屏障功能障碍等病理改变,对神经元存活的影响。方法动物模型的建立,动物分组及干预治疗措施同第一部分,按实验方案,分批处死,术后3h,12h,24h,3d、7d标本分别采用干湿重法测量脑水肿含量,EB含量测定观察损伤侧大脑血脑屏障通透性的改变。术后3d、7d、14d标本进行HE染色观察组织损伤病理改变,术后28d标本尼氏染色观察海马齿状回神经细胞生存情况,同时观察脑损伤范围的改变。结果HE染色发现TBI组损伤早期大量神经元坏死,水肿,炎细胞浸润,晚期见胶质细胞增生；HS组损伤早期神经元死亡、丢失减少,细胞水肿不明显,后期胶质细胞增生减少。尼氏染色计算损伤面积发现TBI组为31.2±4.35mm3,HS组损伤面积为18.90±3.58mm3 (t=12.03, P<0.05)。计算损伤区周围及海马DG区神经元细胞存活显示TBI组损伤区域周围及DG区神经元明显少于HS组(F=21.35,P<0.05)。称重发现TBI组及HS组脑细胞含水量与术后3h开始逐渐增高,大约24h左右可以达到高峰,在术后3d、7d再次进行称重实验发现HS组含水量明显低于TBI组,差异有统计学意义(F=11.82,P<0.05)。EB含量测定可以反映血脑屏障通透性的变化,本实验发现术后24h检测EB的含量TBI组和HS组高于sham组约9倍左右(F=14.66,P<0.05),3d后HS组EB含量低于TBI组,差异有统计学意义(F=9.81,P<0.05)。结论富氢生理盐水可以降低脑水肿及血脑屏障通透性改变,延缓病理性损伤改变,来促进减少损伤面积及保护神经元存活,来发挥治疗。第三部分 富氢生理盐水在大鼠创伤性颅脑损伤的脑保护作用分子机制目的观察富氢盐水影响下列炎症因子IL-6、IL-1、TNF-a-表达式,分析丙二醛(MDA)含量的本身变化,超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)动态变化检测、和神经细胞凋亡和细胞凋亡蛋白的表达变化。方法采用目前通行改良Feeney法建立颅脑损伤大鼠模型,大鼠随机分为Sham组、TBI组、HS组,HS组给予每只大鼠富氢生理盐水10ml/kg/d腹腔注射,连用7d。随机抽取每组大鼠5只,术后3h、12h、24h、3d、7d采用ELISA法测定炎症因子IL-1、IL-6、TNF-a的表达差异；取脑组织,制成均浆根据试剂盒,测定超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)动态变化数据和丙二醛(MDA)含量的变化。术后改变7dTUNEL法观察细胞凋亡和GFAP蛋白的表达,免疫印迹检测、半胱天冬酶3.Bcl-2、Bax蛋白表达。结果通过ELISA检测下列炎症因子IL-1及,IL-6,发现在TBI组(生理盐水组)及HS组(富氢组)术后3h开始其含量逐渐升高,24h能够达到高峰,两组表达趋势基本相同,分析其差异无统计学意义(F[IL-1]=1.88,P>0.05；F[IL-6]=2.44,P>0.05),但是表达量明显高于sham组(F(IL-1]=41.07,P<0.05;F[IL-6].22.65,P<0.05),在3,7d,HS组表达明显低于TBI组,差别具有统计学意义(F[IL-1]=25.15,P<0.05;F[IIL-6]=14.30,P<0.05)；而在TBI组及HS组肿瘤因子(TNF-a)表达持续升高,3d后下降,两组比较差异无显著性(F=2.04,P>0.05),但是高于sham组(F=15.39,P<0.05)。检测3组模型发现超氧化物歧化酶(SOD)含量变化数据sham组显示最低(F=311.5,P<0.05),而HS组明显高于TBI组,对比发现差别有统计学意义(F=124.2,P<0.05)；丙二醛(MDA)含量变化数据sham组最高(F=8.103,P<0.05),但是,HS组却明显低于TBI组,差异有统计学意义(F=165.5,P<0.05)；而GSH-px表达在sham组最高(F=11.61,P<0.05),但是,HS组却高于TBI组明显,显示其差别有统计学意义((F=6.008,P<0.05))。生理盐水组(TBI)组术后7d细胞开始出现明显凋亡,并且,发现GFAP表达多于HS组(P<0.05),同时caspase-3和Bax蛋白表达多于富氢生理盐水组注射(HS)组((P<0.05)),Bcl-2蛋白低于HS组(P<0.05)。结论富氢生理盐水可以抑制下列炎症因子IL-6、IL-1的表达,清除自由基抗氧化损伤,通过提高Bcl-2蛋白水平,通过较低的伯灵顿蛋白质表达方式,减少细胞凋亡的发生,发挥神经系统的保护机制。