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蛋白质对生命体的构成具有非常重要的意义,血清白蛋白是人和哺乳类动物体内最为丰富的蛋白质,其对存储和转运人体的内源和外源物质起着非常重要的作用。对蛋白质进行定量分析和对蛋白质与内源或外源物质结合特性进行研究对探讨生命机理是十分重要的。蛋白质溶液构象、蛋白质与小分子或生物大分子相互作用等结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制,对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。
稀土离子与生物大分子间有很强的亲和力,稀土及其配合物与蛋白质等大分子作用后能发射特征荧光,具有光谱线窄、激发态寿命长、Stocks位移大等优点,稀土荧光探针用于生物大分子分析具有很高的灵敏度和选择性,甚至可以得到蛋白质大分子结构信息。铽(Ⅲ)是镧系稀土离子中典型的生物探针之一,目前,利用铽(Ⅲ)对蛋白质进行分析的研究非常活跃,主要是通过研究铽(Ⅲ)-蛋白质荧光体系的光谱性质,揭示自身或者其他一些金属离子同蛋白质之间的结合位置和结合常数,进而研究铽(Ⅲ)与蛋白质之间的作用机理,但是目前关于铽(Ⅲ)-蛋白质.配体.表面活性剂之间作用机理的理论解释还不完善。事实上,在Tb(Ⅲ)-蛋白质这样一个简单体系的基础上,通过设计含有不同配体,表面活性剂的系列荧光体系进行系统研究,可以更立体化地获得铽(Ⅲ)-蛋白质及其配体间的相互作用信息。本论文通过对Tb<3->-BSA-诺氟沙星(NFLx),Tb<3+>-BSA-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)-十二烷基苯磺酸钠(SDBS),Tb<3+>-BSA-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)-十二烷基苯磺酸钠(SDBS)-Al<3+>四种不同但又相关联的体系进行荧光光谱研究,并结合热力学研究方法,探讨了Tb<3+>-BSA系列体系中铽(Ⅲ)与蛋白质及其配合物之间的作用机理,并给出了合理的解释。
本文的主要内容如下:
1.对Tb<3+>-牛血清白蛋白(BSA)-诺氟沙星(NFLX)体系进行了研究,发现BSA能增强诺氟沙星的特征荧光,而且这种增强作用与NFLX/Tb<3+>的浓度比值有一定的相关性。结果表明:当[NFLX/Tb<3+>在1/8~1/12范围内时,BSA的加入量与体系的荧光增强(△F)有良好的线性关系,线性范围为0~25gg/mL,相关系数R=0.998。研究了酸度及干扰物质对诺氟沙星荧光增强的影响, 15~1000倍量干扰物质的存在,对测定结果未见明显影响,利用所建立的方法对合成样品进行了测定,回收率在101%~102%。探讨了BSA的存在对诺氟沙星.Tb<3+>体系荧光增强的作用机理,实验结果表明,诺氟沙星荧光增强是由于BSA的裸露基团能和诺氟沙星竞争络合Tb<3+>,将诺氟沙星-Tb<3+>体系中的诺氟沙星部分置换出来所致。
2.研究了Tb<3+> -BSA-TTA-SDBS体系的荧光特性,结果表明:当溶液中只有Tb<3+> -TTA或Tb<3+>-SDBS时体系中Tb<3+>荧光强度很弱,而当Tb<3+>-TTA-SDBS同时存在时,Tb<3+>的特征荧光才能明显的表现出来,BSA对体系中Tb<3+>的荧光有明显的增强作用。试验了酸度、TTA浓度、Tb<3+>浓度、SDBS浓度、以及外来物质浓度对Tb<3+>荧光强度的影响,在最优化条件下,Tb<3+>的荧光强度与BSA的浓度在7.0x10<-9>g/mL-5.0x10<-6>g/mL,范围呈线性关系,检出限为7.0x10<-10>g/mL,用所建立的方法对合成样品进行了测定,回收率在82.5%~103%。探讨了体系荧光增强的机理。实验获得的荧光光谱表明:Tb<3+>能与TTA或SDBS结合并发生能量传递,但能量传递效率都不高。通过荧光和共振光散射实验对TTA、SDBS与Tb<3+>结合形式进行分析,证实TTA和SDBS对Tb<3+>的结合都存在络合作用,并且SDBS对Tb<3+>除了络合作用之外还存在以静电吸引力方式结合的可能。此外还从能级跃迁的角度分析了TTA和SDBS对Tb<3+>荧光光谱的影响,结果表明:作为配体的TTA和SDBS对Tb<3+>有协同作用,使配体自身能级跃迁方式发生变化,使得体系的能级跃迁发生了改变,最终导致体系荧光增强。
3.研究了Tb<3+>-BSA<+>-TTA-SDBS-Al<3+>体系的荧光特性,发现在Tb<3+>-TTA-SDBS或者Tb<3+>-TTA-SDBS-BSA体系中加入Al<3+>都能使体系的荧光增强。试验了酸度、TTA浓度、Tb<3+>浓度、SDBS浓度、Al<3+>浓度以及干扰物质对体系中Tb<3+>荧光增强的影响,在最优化的条件下,体系的荧光强度与BSA浓度在5.3x10<-9>g/mL -2.0x10<-5>g/mL范围呈线性关系,检出限:5.3x10<-10>g/mL,对合成样品进行测定,回收率在88.0%~90.0%。探讨了体系荧光增敏的机理,初步认为Al<3+>对体系的荧光强度的增强是由于TTA对Al<3+>的络合引起的。
4.采用热力学数据对TTA-Tb<3+>-SDBS-BSA体系的作用机理进行了探讨,研究了TTA、SDBS对BSA荧光的影响,发现TTA、SDBS都能够使BSA的荧光猝灭,根据动态猝灭的Stem.Volmer关系和静态猝灭的Lineweaver-Burk关系我们得出TTA、SDBS与BSA的结合都是一个静态的猝灭过程。由热力学参数△H、△S、△G得出TTA与。BSA之间的结合力是静电、VanderWaals力,而SDBS与BSA之间的结合力是疏水作用力。根据SDBS/TTA与BSA分子间结合距离的求算的结果表明,TTA与BSA结合时距离212位色氨酸约为3.35nm。同步荧光的分析结果表明,SDBS的存在引起了蛋白质构型的强烈收缩,综合研究结果表明:BSA对FTA-Tb<3+>-SDBS的增敏是由于BSA自身构型变化的结果。研究了诺氟沙星-Tb<3+>-牛血清白蛋白的作用机理,试验了诺氟沙星对BSA荧光的影响,发现NFLX能够使得BSA的荧光猝灭,从已有的文献分析可以得出NFLX与BSA的结合都是一个静态的猝灭过程,NFLX也引起了蛋白质构型部分收缩,Tb<3+>与BSA具有较强的结合力,所以BSA从Tb<3+>-NFLx体系中置换NFLX是有可能的。
综合实验和分析结果表明:本文依据理论推导得出的结论与实验结果比较吻合,较合理地解释了铽(Ⅲ)-蛋白质及其配体之间的结合机理。