食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，尤其是河南和河北省的南部地区发病率高，疗效差，我国食管癌不同于国外，主要为鳞状细胞癌。目前，放射治疗是食管癌的主要治疗手段之一，然而，单纯放疗后5年生存率仅为10～30%，肿瘤局部未控率和复发率高达60%～80%。如何增加食管癌细胞的放射敏感性，提高肿瘤局部控制率、减少复发，从而提高食管癌放疗疗效是目前关注的热点。随着有关肿瘤放射敏感性的分子和细胞生物学研究的不断深入，目前已发现多种与肿瘤放射敏感性相关的基因及其表达产物，包括细胞周期调控基因、凋亡基因、DNA损伤修复蛋白等，提示肿瘤细胞中一定基因的改变是影响细胞放射敏感性的重要因素。ubiquitin-likewith PHD and ring finger domains1（UHRF1）是最新发现的一种与细胞生长有关的核蛋白基因，参与了细胞增殖、周期调控及放射敏感性等重要的生物学过程。UHRF1蛋白含有较多的结构域，可与DNA甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶相互作用实现对DNA甲基化、组蛋白乙酰化及甲基化的正性调控，是一种重要的表观遗传学调控因子。临床研究显示，UHRF1在多种肿瘤组织中过表达，并且其表达水平与肿瘤恶性行为和不良预后密切相关，成为癌症研究中的重要靶标之一。近期研究还发现，UHRF1参与了放射拮抗，UHRF1缺失的鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）与野生型和杂合型的相比，其对放射线和致癌剂单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）有较高的敏感性；转染正义UHRF1的人乳癌MDA-MB-231细胞和宫颈癌Hela细胞放射敏感性降低，提示UHRF1有可能成为肿瘤放射治疗增敏的新靶点。然而，目前UHRF1在食管鳞癌中的表达水平及意义尚不清楚。RNA干扰技术是一种快速、简洁、经济的抑制基因表达的技术，尤其给肿瘤的基因治疗带来了新希望，慢病毒作为一种高效的基因治疗载体可将其所携带的目的基因整合到细胞基因组，稳定长期表达，从而可长时间抑制目的基因的表达，具有其独特的优势。本研究首先通过观察食管鳞癌组织及正常食管组织中UHRF1的表达情况分析其与临床病理特征和放疗疗效之间的关系；其次，通过慢病毒介导的RNA干扰技术阻抑其表达，分析该基因对食管鳞癌TE-1细胞基本生物学行为和放射敏感性的影响，并初步探讨其影响放射敏感性的机制，为食管鳞癌放射增敏及基因治疗提供新的靶点。第一部分UHRF1在食管鳞癌的表达及其与放疗疗效关系的临床研究目的：探讨UHRF1在食管鳞癌组织和细胞中的表达水平并分析其与临床病理特征和放疗疗效的关系。方法：选取50例手术切除的食管鳞癌新鲜组织及癌旁正常组织，同时选取三种食管鳞癌细胞株TE-1、TE-13及Eca109，通过半定量RT-PCR、Western blot检测UHRF1mRNA和蛋白的表达水平，分析其与临床病理特征的联系；另选接受单纯放疗的食管鳞癌患者的放疗前癌组织咬检标本61例，采用免疫组化法检测UHRF1蛋白的表达水平，分析其与放疗反应的关系。结果：RT-PCR、Western blot和免疫组化检测均发现，UHRF1mRNA和蛋白在正常食管组织中不表达或低表达，在食管鳞癌组织和细胞中均高表达（P<0.01），且UHRF1表达水平与食管鳞癌的的浸润深度、淋巴结转移、组织学分级密切相关，即浸润深度越深、伴有淋巴结转移、组织分化不良者，UHRF1表达水平越高（P<0.05）；单纯放疗组UHRF1表达水平与放疗疗效密切相关，即放疗疗效越差者，UHRF1表达水平越高（P<0.05）。结论：UHRF1在食管鳞癌组织和细胞中均为高表达，与肿瘤的发生发展、侵袭转移及放疗抵抗密切相关。第二部分慢病毒介导的UHRF1-shRNA干扰表达载体的构建及对食管鳞癌细胞生物学行为的影响目的：构建慢病毒介导的UHRF1-shRNA干扰表达载体，探讨其对食管鳞癌TE-1细胞生物学行为的影响。方法：设计4对UHRF1基因的反义寡核苷酸片段，经过退火及酶切后，克隆入pGCSIL-GFP质粒，体外扩增纯化后，得到重组构建的pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA干扰质粒，筛选干扰效果最佳的质粒与慢病毒包装载体一起转染工具细胞后获得携带有干扰质粒或空质粒的病毒液转染TE-1细胞，荧光显微镜下筛选稳定表达株；RT-PCR及Western blot检测转染后TE-1细胞中UHRF1mRNA和蛋白表达水平的变化；采用MTT法、流式细胞仪、Transwell体外侵袭实验检测UHRF1-shRNA干扰对TE-1细胞增殖、周期、凋亡和侵袭的影响。结果：成功构建了4个shRNA表达载体pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA1、 pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA2、pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA3和pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA4，并筛选出抑制效果最佳的pGCSIL-GFP-UHRF1-shRNA1表达载体转染TE-1细胞，得到稳定表达细胞株；RT-PCR及Western blot结果显示UHRF1-shRNA1能够抑制TE-1细胞中UHRF1mRNA和蛋白的表达；同时使细胞增殖能力及体外侵袭能力明显下降（P<0.01），G0/G1期细胞增多（P<0.05），细胞凋亡显著增加（P<0.01）。结论：慢病毒介导的UHRF1-shRNA干扰表达载体，可抑制TE-1细胞增殖和侵袭能力，引起细胞G0/G1期阻滞，诱导细胞凋亡。第三部分慢病毒介导的UHRF1-shRNA干扰表达载体对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响及机制目的：探讨慢病毒介导的UHRF1-shRNA干扰表达载体对食管鳞癌TE-1细胞放射敏感性的影响及其机制。方法：采用慢病毒介导的UHRF1-shRNA1干扰表达载体转染TE-1细胞后进行X线照射，采用克隆实验检测UHRF1-shRNA1转染对TE-1细胞放射敏感性的影响；采用流式细胞术及Western blot法分别从细胞周期、凋亡及周期相关蛋白CyclinB1、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-8、DNA损伤修复蛋白Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Rad51水平分析其相关机制。结果：克隆形成实验显示，经0～8Gy X线照射后，UHRF1-shRNA1转染组存活曲线下降，D0、Dq、N和SF2值均明显低于未转染组和空质粒组（P<0.01），放射增敏比为1.53（D0值比）和1.95（Dq值比）。进一步分析显示，8Gy X线照射可引起TE-1细胞G2/M周期阻滞，诱导凋亡并导致细胞周期蛋白CyclinB1表达降低，凋亡相关蛋白Bax和Caspase-8以及DNA损伤修复蛋白Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Rad51表达增加，而UHRF1-shRNA1转染可降低放射诱导的G2/M期阻滞（P<0.01），增加放射诱导的细胞凋亡（P<0.01），并且可上调TE-1细胞自身和放射诱导的Bax、Caspase-8蛋白表达（P<0.01），下调自身和放射诱导的Ku70和Ku80蛋白的表达（P<0.01），而对CyclinB1、DNA-PKcs和Rad51蛋白表达无明显影响（P>0.05）。结论：UHRF1-shRNA1转染可增强TE-1细胞对放射线的敏感性，其增敏机制可能与调控细胞周期和凋亡相关蛋白及DNA损伤修复蛋白的表达，从而降低放射诱导的G2/M期阻滞和DNA损伤修复能力，增加细胞凋亡有关。