猪流行性腹泻是猪的一种急性、高度接触性的肠道传染病,由猪流行性腹泻病毒(PEDV)所引起。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和食欲下降为基本特征。各年龄猪均易感,但以新生仔猪最为严重,其发病率和死亡率可达90%-100%。尽管该病首先发现于欧洲,但其广泛流行于包括中国、韩国、菲律宾等在内的许多亚洲国家,并已成为严重危害养猪业的主要传染病之一。反向遗传操作系统可为研究病毒的复制与转录机制及各基因的功能等提供有用的工具。因此,本研究以PEDV流行毒株AJ1102为研究对象,开展了PEDV反向遗传操作系统的相关构建工作,主要内容包括:1.PEDV全长c DNA克隆的构建根据PEDV AJ1102株的全基因组序列设计引物,利用RT-PCR以及融合PCR的方法扩增获得覆盖PEDV AJ1102株全基因组的6个片段(A、B、C、D、EF、G),扩增的同时在A片段的5’端引入正确的CMV启动子序列。通过对细菌人工染色体p Belo BAC11载体进行改造,构建了含有CMV早期启动子序列、PEDV5’端序列、多克隆位点、PEDV3’端序列、核酶HDV序列和BGH终止序列的中间载体p Belo-AJ1102-5’-3’。将获得的6个片段依次克隆到p Belo-AJ1102-5’-3’中间载体上,获得该毒株全长c DNA克隆p Belo-AJ1102,为进一步构建其感染性克隆奠定了基础。2.PEDV复制子的构建在构建PEDV AJ1102株全长c DNA克隆的基础上,同时构建了PEDV复制子的c DNA克隆。首先利用PCR方法对EF片段上的S、ORF3、E、M基因进行缺失,而保留与猪流行性腹泻病毒复制相关的N蛋白基因序列以及N基因上游的TRS序列,同时分别引入Luc和EGFP报告基因,将改造后的EF片段分别命名为H(H-EGFP)片段和I(I-Luc)。同构建PEDV全长c DNA克隆一样,将H、I片段分别克隆到p Belo-ABDG中间载体上后插入C片段,分别获得含有Luc和EGFP报告基因的复制子质粒p Belo-AJ1102-EGFP-rep、p Belo-AJ1102-Luc-rep。