论文部分内容阅读
目的:从电生理角度观察葛根素对单个心室肌细胞动作电位的影响,以及对HEK293细胞上表达的KCNQ1(KvLQT1)、KCNQ1/KCNE1(IKs)、KCNJ2(Kir2.1)和KCNJ4(Kir2.3)通道电流的影响,探讨葛根素抗心律失常的作用机制。方法:急性分离大鼠心脏,使用Langendoff系统经主动脉逆向灌流,胶原酶Ⅱ酶解获得单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录技术观察不同浓度(0.01,0.1,1mM)葛根素对大鼠心室肌细胞动作电位的影响;培养HEK293细胞,分别用脂质体瞬时转染pcDNA3.1-KCNQ1、pcDNA3.1-KCNQ1与pcDNA3.1-KCNE1、pcDNA3.1-KCNJ2、pcDNA3.1-KCNJ4质粒,于24~48h对转染后的细胞进行全细胞和内膜向外模式电生理记录,观察不同浓度(0.1~10mM)葛根素对通道电流的影响。此外,观察β受体激动剂异丙肾上腺素(100nM)、蛋白激酶A激动剂8-Br-cAMP(100μM)、腺苷酸环化酶激动剂Forskolin(10μM)、PI3K通路抑制剂LY294002(10μM)以及PLC信号通路抑制剂U73122(10μM)对1mM葛根素抑制后的KvLQT1通道电流的影响。结果:0.01mM、0.1mM、1mM葛根素分别使大鼠心室肌细胞静息膜电位从(﹣80.1±2.7)mV变为(﹣78.5±4.2)mV、(﹣83.3±7.6)mV和(﹣84.7±5.1)mV(均n=6,P>0.05);使动作电位超射幅度从(112.5±6.3)mV变为(109.8±8.5)mV、(114.2±4.9)mV和(115.9±6.2)mV(均n=6,P>0.05);使APD90从(164.6±21.4)ms延长至(188.3±11.5)ms、(221.6±25.7)ms和(278.7±38.2)ms(均n=6,P<0.05);使APD50从(71.8±11.8)ms延长至(86.9±10.7)ms、(100.5±14.1)ms和(123.6±25.4)ms(均n=6,P<0.05)。当葛根素的浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM和10mM时,对KvLQT1稳态电流密度抑制率分别为(2.35±0.50)%、(5.69±2.88)%、(17.20±2.74)%、(57.71±3.45)%、(72.94±3.77)%和(75.78±2.04)%(均n=6,P<0.05);对KvLQT1tail稳态电流密度抑制率分别为(5.21±0.39)%、(8.12±2.37)%、(15.32±4.75)%、(63.23±2.82)%、(75.97±1.99)%和(80.42±3.90)%(均n=6,P<0.05);对IKs峰值电流密度的抑制率分别为(3.19±4.11)%、(8.87±3.66)%、(17.81±2.52)%、(40.44±1.90)%、(60.99±3.21)%和(63.18±2.18)%(均n=6,P<0.05);对IKs tail峰值电流密度的抑制率分别为(4.98±0.45)%、(7.78±1.63)%、(14.32±1.75)%、(45.23±2.82)%、(63.25±2.73)%和(65.42±3.90)%(均n=6,P<0.05)。当葛根素的浓度为10mM、50mM、100mM和200mM时,对Kir2.1稳态电流密度抑制率分别为(28.20±2.80)%、(52.36±1.76)%、(52.42±3.07)%和(53.11±3.81)%(均n=6,P<0.05);对Kir2.3稳态电流密度抑制率分别为(11.04±2.89)%、(25.89±2.21)%、(38.56±3.39)%和(57.18±4.15)%(均n=6,P<0.05)。100mM葛根素使标准化后的Kir2.3单通道开放率减小(32.91±4.60)%(n=6,P<0.05),通道电导为(14.42±0.14)pS,无显著性变化;100μM葛根素分别使标准化后的KvLQT1和IKs单通道开放率减小(49.78±7.65)%和(54.25±8.22)%(均n=6,P<0.05),通道电导分别为(4.43±1.47)pS和(15.89±3.83)pS,无显著性变化。异丙肾上腺素(100nM)、8-Br-cAMP(100μM)、Forskolin(10μM)、LY294002(10μM)以及U73122(10μM)对1mM葛根素预处理的KvLQT1通道电流的抑制率分别为(38.81±6.42)%、(46.89±3.80)%、(56.37±7.97)%、(63.53±4.98)%和(52.34±5.73)%(均n=6,P<0.05)。结论:葛根素可浓度依赖性的延长大鼠心室肌细胞动作电位时程,其抗心律失常作用主要通过抑制KvLQT1、IKs、Kir2.1和Kir2.3通道电流。葛根素可作用于细胞膜内表面,直接抑制KvLQT1通道电流,也可通过间接作用于β肾上腺素受体-PKA-cAMP信号通路来抑制KvLQT1通道电流;另外,LY294002和U73122通过增加细胞内PIP2使KvLQT1通道电流增大,葛根素可竞争性拮抗这一效应。