论文部分内容阅读
目的：从电生理角度观察葛根素对单个心室肌细胞动作电位的影响，以及对HEK293细胞上表达的KCNQ1（KvLQT1）、KCNQ1/KCNE1（IKs）、KCNJ2（Kir2.1）和KCNJ4（Kir2.3）通道电流的影响，探讨葛根素抗心律失常的作用机制。方法：急性分离大鼠心脏，使用Langendoff系统经主动脉逆向灌流，胶原酶Ⅱ酶解获得单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳记录技术观察不同浓度（0.01,0.1,1mM）葛根素对大鼠心室肌细胞动作电位的影响;培养HEK293细胞，分别用脂质体瞬时转染pcDNA3.1-KCNQ1、pcDNA3.1-KCNQ1与pcDNA3.1-KCNE1、pcDNA3.1-KCNJ2、pcDNA3.1-KCNJ4质粒，于24～48h对转染后的细胞进行全细胞和内膜向外模式电生理记录，观察不同浓度（0.1～10mM）葛根素对通道电流的影响。此外，观察β受体激动剂异丙肾上腺素（100nM）、蛋白激酶A激动剂8-Br-cAMP（100μM）、腺苷酸环化酶激动剂Forskolin（10μM）、PI3K通路抑制剂LY294002（10μM）以及PLC信号通路抑制剂U73122（10μM）对1mM葛根素抑制后的KvLQT1通道电流的影响。结果：0.01mM、0.1mM、1mM葛根素分别使大鼠心室肌细胞静息膜电位从（﹣80.1±2.7）mV变为（﹣78.5±4.2）mV、（﹣83.3±7.6）mV和（﹣84.7±5.1）mV（均n=6，P＞0.05）；使动作电位超射幅度从（112.5±6.3）mV变为（109.8±8.5）mV、（114.2±4.9）mV和（115.9±6.2）mV（均n=6，P＞0.05）；使APD90从（164.6±21.4）ms延长至（188.3±11.5）ms、（221.6±25.7）ms和（278.7±38.2）ms（均n=6，P＜0.05）；使APD50从（71.8±11.8）ms延长至（86.9±10.7）ms、（100.5±14.1）ms和（123.6±25.4）ms（均n=6，P＜0.05）。当葛根素的浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM、1mM和10mM时，对KvLQT1稳态电流密度抑制率分别为（2.35±0.50）%、（5.69±2.88）%、（17.20±2.74）%、（57.71±3.45）%、（72.94±3.77）%和（75.78±2.04）%（均n=6，P＜0.05）；对KvLQT1tail稳态电流密度抑制率分别为（5.21±0.39）%、（8.12±2.37）%、（15.32±4.75）%、（63.23±2.82）%、（75.97±1.99）%和（80.42±3.90）%（均n=6，P＜0.05）；对IKs峰值电流密度的抑制率分别为（3.19±4.11）%、（8.87±3.66）%、（17.81±2.52）%、（40.44±1.90）%、（60.99±3.21）%和（63.18±2.18）%（均n=6，P＜0.05）；对IKs tail峰值电流密度的抑制率分别为（4.98±0.45）%、（7.78±1.63）%、（14.32±1.75）%、（45.23±2.82）%、（63.25±2.73）%和（65.42±3.90）%（均n=6，P＜0.05）。当葛根素的浓度为10mM、50mM、100mM和200mM时，对Kir2.1稳态电流密度抑制率分别为（28.20±2.80）%、（52.36±1.76）%、（52.42±3.07）%和（53.11±3.81）%（均n=6，P＜0.05）；对Kir2.3稳态电流密度抑制率分别为（11.04±2.89）%、（25.89±2.21）%、（38.56±3.39）%和（57.18±4.15）%（均n=6，P＜0.05）。100mM葛根素使标准化后的Kir2.3单通道开放率减小（32.91±4.60）%（n=6，P＜0.05），通道电导为（14.42±0.14）pS，无显著性变化;100μM葛根素分别使标准化后的KvLQT1和IKs单通道开放率减小（49.78±7.65）%和（54.25±8.22）%（均n=6，P＜0.05），通道电导分别为（4.43±1.47）pS和（15.89±3.83）pS，无显著性变化。异丙肾上腺素（100nM）、8-Br-cAMP（100μM）、Forskolin（10μM）、LY294002（10μM）以及U73122（10μM）对1mM葛根素预处理的KvLQT1通道电流的抑制率分别为（38.81±6.42）%、（46.89±3.80）%、（56.37±7.97）%、（63.53±4.98）%和（52.34±5.73）%（均n=6，P＜0.05）。结论：葛根素可浓度依赖性的延长大鼠心室肌细胞动作电位时程，其抗心律失常作用主要通过抑制KvLQT1、IKs、Kir2.1和Kir2.3通道电流。葛根素可作用于细胞膜内表面，直接抑制KvLQT1通道电流，也可通过间接作用于β肾上腺素受体-PKA-cAMP信号通路来抑制KvLQT1通道电流；另外，LY294002和U73122通过增加细胞内PIP2使KvLQT1通道电流增大，葛根素可竞争性拮抗这一效应。