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研究背景及目的肺癌是目前全球发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,由于早期症状不典型,大多数肺癌患者确诊时就已经是中晚期,5年生存率极低,积极寻求新的有效的治疗靶点和靶向药物显得极其重要。化疗是抑制肿瘤细胞生长的经典方法,但是化疗又会带来一系列毒副作用,如胃肠道反应、肝肾功能损害、脱发等,严重影响了患者的生活水平。虽然一些靶向药物如EGFR-TKIs取得了不错的治疗效果,但是,靶向药物治疗一段时间后又会引发耐药性问题,这提示我们需要不断推进癌症的研究。并且,Kras突变基因作为非小细胞肺癌的常见突变位点之一,目前临床上却还没有有效的治疗药物,因此,积极研究Kras突变诱导的肺癌的发病机制和调控因素,寻找相应干预及治疗的药物,具有重要的意义。细胞分裂周期蛋白42(Cdc42,cell division cycle42),作为小G蛋白家族的重要成员,在调节细胞运动、细胞骨架、细胞增殖、细胞转化、肿瘤细胞的转移等方面起着非常重要的作用。近几年来,Cdc42被发现在多种恶性肿瘤中表达升高,参与了调节肿瘤细胞的增殖、转化和转移,然而,其在肺癌中的作用和分子机制尚不清楚。研究方法1.体内实验:1.1利用Tet-On系统和cre/loxp技术构建肺癌小鼠模型和肺癌基础上II型肺泡上皮特异性敲除Cdc42基因小鼠模型,进行后续实验;1.2全部小鼠的左侧肺叶组织进行固定、脱水、包埋及HE染色;右侧肺叶组织提取蛋白,通过western blot方法检测Cdc42蛋白的表达水平;1.3给各组小鼠雾化吸入ML141,进行HE染色观察肿瘤生长情况。2.体外实验2.1选用A549肺癌细胞系,利用siRNA干扰技术敲低Cdc42表达水平;在此模型基础上,用CCK8实验、Ki67荧光染色、流式细胞周期、集落形成实验等方法检测细胞增殖状态,划痕实验探究细胞迁移能力,Transwell实验探究细胞迁移和侵袭能力;2.2提取细胞蛋白,通过western blot方法检测Cdc42水平;2.3用不同浓度ML141处理细胞,通过CCK8实验检测细胞增殖活性;2.4提取细胞RNA,进行转录组测序方法分析Cdc42下游基因及信号转导通路的变化。3.统计学处理分析研究结果1.成功构建了 Kras突变的肺癌小鼠模型杂交得到目的基因小鼠后,予Dox饲养3个月后,可以得到肺癌模型。2.成功构建了II型肺泡上皮特异性敲除Cdc42基因的肺癌小鼠模型构建动物模型后,敲除Cdc42组形成的肿瘤数量和大小均明显少于未敲除组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.稳定构建了敲低Cdc42水平的A549细胞系A549细胞转染siControl-RNA及siCdc42-RNA后,敲低Cdc42明显抑制Cdc42蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。4.敲低A549细胞系中Cdc42表达对细胞增殖、迁移、侵袭的影响与对照组相比,敲低Cdc42组的细胞增殖、迁移、侵袭能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。5.ML141对细胞及肺癌模型的影响ML141处理A549细胞后,高浓度的ML141明显抑制细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05);ML141处理肺癌模型后,与肺癌组相比,肿瘤形成明显减少。6.敲低A549细胞Cdc42的表达影响多种基因及信号通路转录组测序分析表明,敲低Cdc42后,下游多种基因及信号通路发生改变,其中主要信号通路有 ECM-receptor interaction,microRNAs in cancer,p53 signalling pathway,focal adhesion和 PI3K-Akt signalling pathway。研究结论1.利用条件性基因敲除技术在小鼠体内定时在肺泡上皮细胞上表达Kras突变基因,成功构建小鼠体内原位肺癌模型,该模型也证实癌基因Kras具有强大的诱导肺癌形成的能力。2.Cdc42与肺癌的关系:小鼠肺癌组织中Cdc42表达升高,敲除Cdc42基因降低了肺癌的增殖、转移能力,因此Cdc42在未来有可能成为治疗肺癌的靶点之一。3.Cdc42与肺癌的作用机制:A549肺癌细胞中下调Cdc42表达水平影响了下游多种基因和信号转导通路,因而Cdc42可能通过多种靶点发挥作用的,细胞外基质相关基因的改变可能起最重要的作用。