背景及目的肺癌是世界范围内癌症所致死亡的头号杀手,而且其发病率持续上升。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的一种主要类型,大约占所有肺癌的80%,尽管近年来化学疗法、放射治疗以及手术治疗等常规疗法均有所进展,仍不能有效提高患者的5年生存率。因此,必须发展新的方法/试剂以建立对抗NSCLC的有效治疗策略。多数肿瘤的发生是由增殖和凋亡信号的失衡而致。糖原合酶激酶3 ( glycogen synthase kinase 3,GSK3 ),一种具有广泛底物的丝/苏氨酸磷酸激酶,可参与细胞的增殖、分化及凋亡等多种生命活动。GSK3包含两种亚型GSK3α和GSK3β,在静息细胞内呈组成性激活,其N末端丝氨酸残基(Ser21-GSK3α,Ser9-GSK3β)的磷酸化可导致其活性抑制。最近的研究表明,肺癌的发生与Wnt信号失调密切相关,GSK3是Wnt信号途径的关键因子,而且在肺泡上皮中丰富表达,但关于GSK3在肺癌发生发展中的作用却知之甚少。因此,本实验利用人肺腺癌细胞株A549细胞探讨GSK3β对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法GSK3β选择性抑制剂LiCl或瞬时转染GSK3β突变体质粒处理A549细胞后,利用CCK-8细胞增殖实验及细胞计数方法检测GSK3β活性变化对A549细胞生长的影响;利用流式细胞仪进行细胞周期分析;利用免疫荧光技术、共聚焦显微镜等进行形态学观察;利用AnnexinⅤ/PI双标染色、FITC标记的TUNEL检测试剂盒分析凋亡;利用western blot检测相关蛋白表达变化;利用免疫共沉淀方法检测GSK3β和survivin之间是否存在直接的相互作用。结果本实验首先利用LiCl处理A549细胞后,观察LiCl对A549细胞生长特性的影响。结果:(1)CCK-8细胞增殖实验结果显示,LiCl对A549细胞的增殖具有促进作用(P<0.05),且在一定范围内(1~20 mmol/L),随药物浓度增加,细胞增殖速度加快,呈剂量-效应关系。(2)流式细胞术细胞周期分析显示,与对照组相比,10 mmol/L LiCl加药组G1期细胞数量明显减少(P<0.05),S期细胞数明显上升(P<0.05);20 mmol/L LiCl处理组各期细胞分布变化趋势与之相同而且更加显著(分别P<0.01)。(3)免疫细胞荧光技术检测显示,10 mmol/L LiCl及20 mmol/L LiCl作用24 h后,A549细胞内GSK3β荧光信号较对照组相比有所减弱,提示GSK3β可能参与了LiCl对A549细胞的生长抑制作用。为进一步证实GSK3β参与A549细胞的生长调节,我们通过瞬时转染GSK3β突变体质粒直接改变A549细胞中GSK3β的活性水平,然后进行形态学观察、细胞计数、细胞周期分析。结果:(1)相差显微镜下,空载体转染组(对照组)细胞呈梭形或多角形,轮廓清楚,生长成片,细胞间连接较为紧密。与对照组相比,显性负突变型质粒DN-GSK3β转染组细胞除细胞数量有所增加之外,细胞形态并没有明显改变。相反,持续激活型S9A-GSK3β转染组细胞数量明显下降,而且细胞变得扁平,伸长并皱缩。细胞计数实验指出,S9A-GSK3β转染可能抑制A549细胞增殖,而DN-GSK3β转染则能促进细胞生长(与对照组相比,均P<0.05)。(2)流式细胞术细胞周期分析显示,与对照组相比,S9A-GSK3β转染组G1期细胞百分比明显升高(P<0.01), S期细胞数量降低(P<0.05);而DN-GSK3β转染组G1期细胞比例低于对照组(P<0.05),并伴随S期细胞比例的升高(P<0.05)。同时,western blot检测表明,LiCl处理或DN-GSK3β突变体质粒转染均可导致A549细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1表达升高,而持续激活型S9A-GSK3β转染则明显下调Cyclin D1表达。我们的实验还探讨了GSK3β对A549细胞凋亡的影响。LiCl处理或瞬时转染GSK3β突变体质粒24 h后,将A549细胞进行AnnexinⅤ/PI双标染色并采用流式细胞仪分析。结果显示,与相应的对照组相比,10 mmol/L、20 mmol/L LiCl处理或转染显性负突变型DN-GSK3β质粒均能一定程度抑制A549细胞的凋亡,而转染持续激活型S9A-GSK3β质粒则引起凋亡率的明显升高(P<0.05)。而利用FITC标记的TUNEL检测试剂盒及共聚焦显微镜技术,我们发现,与对照组(转染野生型WT- GSK3β组)相比,持续激活型S9A-GSK3β转染组A549细胞凋亡率明显升高(P<0.05),凋亡阳性细胞呈绿色荧光标记,细胞核固缩或碎裂,并可见凋亡小体形成。以上数据表明,GSK3β在A549细胞中具有促凋亡作用。为探讨凋亡抑制蛋白survivin是否参与了GSK3β的促凋亡作用,我们检测了LiCl处理或GSK3β突变体质粒转染后A549细胞中survivin蛋白的表达。Western blot显示,LiCl处理24 h可导致survivin蛋白表达水平升高,并且此效应呈剂量依赖性。转染GSK3β突变体质粒24 h后,与对照组相比,显性负突变型DN-GSK3β表现出与LiCl相似的作用,即上调A549细胞中survivin的表达;相反地,持续激活型S9A-GSK3β突变体质粒转染组survivin蛋白的表达明显下降。更有趣的是,利用多重免疫荧光技术及激光共聚焦显微镜观察,我们偶然发现了一个重要的现象:与对照组相比,S9A-GSK3β转染组A549细胞中survivin蛋白除表达下降之外,还明显向核内转位。而且,用GSK3β上游激酶PKB的抑制剂LY294002(可提高GSK3β活性)处理A549细胞后,激光共聚焦也显示了相同的现象。这说明:提高GSK3β活性可促进survivin核内转位。进一步作免疫共沉淀实验,我们发现,无论以抗GSK3β抗体还是抗survivin抗体沉淀,沉淀物中都能检测到另一种蛋白(survivin或GSK3β)的存在,说明二者能相互结合于同一复合物中,二者之间可能存在直接作用。结论(1)GSK3β在A549细胞中发挥增殖抑制作用。(2)GSK3β可能通过降解Cyclin D1诱发G1细胞周期阻滞而发挥增殖抑制作用。(3)GSK3β在A549细胞中具有促凋亡作用。(4)GSK3β可能通过下调survivin蛋白表达并促进其核内转位而促进A549细胞的凋亡。本实验提示:在人NSCLC中,GSK3β可能是抗肿瘤效应的一个重要的下游因子,因此,发展制备能够提高GSK3β活性的药物有望成为肺癌治疗的新策略。