论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea Virus,BVDV)引起的接触性传染病,主要引起牛的高热、腹泻、白细胞减少、免疫抑制、黏膜充血等临床症状。目前影响BVDV持续性感染防治的关键因素在于对BVDV持续性感染形成和维持机制等的重大基础理论问题缺乏深入系统的认识,BVDV持续性感染形成和维持的关键在靶细胞和机体两个水平。大量研究表明microRNA(mi RNA)在病原体与宿主细胞相互作用中发挥重要作用,因此,在本研究中将重点从病毒感染细胞后,miRNA调控细胞凋亡、自噬以及免疫角度来揭示BVDV持续感染的机制。目的:通过BVDV感染细胞过程中小RNA分子对细胞凋亡、自噬及对BVDV复制的影响,探讨BVDV持续性感染的分子机制。方法:(1)提取正常的MDBK细胞(MDBKCs)和cpBVDV NADL侵染细胞(BMDBKCs)两个样品的总RNA构建两个样品的miRNA和mRNA文库,并通过生物信息学分析软件对测序的数据进行分析和验证;(2)将合成的miR-2904寡核苷酸转染到MDBK细胞中,并分别利用倒置显微镜、Hoechst染色和流式细胞仪对MDBK细胞的凋亡情况进行检测;并预测和鉴定miR-2904在凋亡信号通路中靶基因caspase-9;检测miR-2904寡核苷酸转染MDBK细胞后caspase-9 mRNA和蛋白表达水平;(3)将cpBVDV NADL感染MDBK细胞后,并利用透射电镜技术检测细胞的自噬情况;构建的GFP-LC3质粒转染至MDBK细胞中,并分别将GFP-LC3质粒和miR-2904mimics/inhibitor/NC mimics共转染至MDBK细胞,对细胞的自噬水平则通过激光共聚焦显微镜进行检测;并预测和鉴定miR-2904在自噬信号通路中靶基因ATG13;检测miR-2904寡核苷酸转染MDBK细胞后ATG13 mRNA和蛋白表达水平;(4)用cpBVDV NADL感染MDBK细胞后,检测免疫相关因子IL-6、IL-1β和IFN-a mRNA水平;并预测和鉴定miR-2904在免疫信号通路中靶基因IL6R;检测miR-2904寡核苷酸转染MDBK细胞后IL6R mRNA表达水平;检测miR-2904寡核苷酸转染MDBK细胞后cp BVDV NADL复制水平的变化。结果:(1)在小RNA测序中,在的对照组(ck)、2 h、6 h和18 h中分别鉴定出290、280、287和298个保守的miRNA以及1042、231、354和775个新的miRNA,在ck-vs-2 h、ck-vs-6 h和ck-vs-18 h中分别鉴定出283、84和54个显著差异的已知miRNA,其中有18个差异表达的miRNAs在不同时间段都有表达;高通量测序的结果与实时定量PCR的验证结果基本保持一致;在RNA-seq测序中,鉴定出ck-vs-2 h有232个差异表达的基因,ck-vs-6h中有135个差异表达的基因,ck-vs-18 h中有185个差异表达的基因,其中有43个差异表达的基因在不同时间段都有表达;miR-2904能够抑制cpBVDV NADL的复制;预测miR-2904凋亡、自噬和免疫相关的靶基因分别有11、6和34个;(2)miR-2904降低了MDBK细胞的凋亡率;miR-2904能直接靶向caspase-9 3’UTR并抑制其表达;(3)cpBVDV NADL感染增加自噬体/自噬溶酶体数量;转染GFP-LC3质粒,胞浆呈现GFP-LC3融合蛋白;共转GFP-LC3和miR-2904 mimics显著性降低GFP-LC3阳性细胞的数量;miR-2904能直接靶向ATG13 3’UTR并抑制其表达;(4)cpBVDV NADL感染MDBK细胞后著性增加了IL-6、IL-1β和IFN-a mRNA水平;miR-2904能直接靶向IL6R 3’UTR并抑制其表达;miR-2904过表达不同程度的降低cpBVDV NADL的复制水平。结论:成功构建了BVDV感染细胞的miRNA和mRNA文库,获得了一批差异显著的miRNAs,其中,miR-2904能显著抑制BVDV的复制,其影响病毒复制的可能机制是miR-2904通过靶向靶基因抑制细胞的凋亡与自噬,进而影响BVDV的复制。