黄姑鱼抗哈维氏弧菌病全基因组关联分析及相关免疫基因功能研究

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黄姑鱼是一种具有重要经济价值的海水鱼类,在中国东南沿海地区(如浙江和福建省)广受欢迎,在福建省已有近30年的养殖历史。随着海水鱼类养殖业发展及养殖规模的扩大,主养区集约化养殖程度过高,导致疾病暴发频繁。多年来黄姑鱼养殖也常常因为病害导致大量死亡,特别是哈维氏弧菌侵袭引发的病害,造成了严重的经济损失。为了揭示黄姑鱼抵御哈维氏弧菌侵害的抗病遗传基础,进而阐明其抗病免疫机制,为开展分子辅助育种奠定基础,本研究利用从染病黄姑鱼上分离到的哈维氏弧菌菌株,对黄姑鱼进行了人工攻毒实验,通过全基因组重测序挖掘SNP标记进行全基因组关联分析(GWAS),定位抗病性状相关的遗传位点,并对筛选到的候选基因进行功能鉴定。主要结果如下:(1)用哈维氏弧菌(1×107 CFU/m L)对700尾黄姑鱼幼鱼进行浸泡攻毒,攻毒后144h达到死亡高峰,216 h后不再出现死亡。取死亡高峰期的197个个体作为易感样本,攻毒后15 d仍存活的148个个体作为抗性样本,对这345个个体进行全基因组重测序,共鉴定出4,340,537个SNPs用于GWAS。GWAS结果显示,显著的SNPs在14号染色体上聚为一簇,其中54个SNPs与黄姑鱼的哈维氏弧菌抗性相关,这些变异的次要等位基因频率范围处于0.1884到0.2899之间。哈维氏弧菌抗性的基因组膨胀因子(λ)为1.01。全基因组所有SNPs能够解释的表型差异的比例(PVE)为38%,54个显著SNP位点分别能够解释的表型差异的比例在0.1064至0.1368之间,其中最显著的SNP Chr14:6518461的PVE为13.68%。对每个显著SNP周围的基因进行扫描后,发现了8个候选基因与哈维氏弧菌抗性相关,并且这些SNPs大多数位于基因的内含子中。特别地,最显著关联的SNP Chr14:6518461位于SPHK1内含子中。此外,在该候选区域内的15个基因的外显子区域中存在77个SNPs,这些SNPs能够导致其相应的三联体密码子发生错义突变,从而可能影响其相应蛋白的功能,可能对黄姑鱼的哈维氏弧菌抗病性具有直接或间接的影响。(2)黄姑鱼SPHK1基因的ORF序列长为1689 bp,预测编码一个由562个氨基酸组成的分子量约为62.11 kDa的蛋白。该蛋白亚细胞定位位于胞质区域。黄姑鱼SPHK1基因在组织或器官中广泛表达,但表达量差异显著。其中,在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低。在哈维氏弧菌攻毒后,黄姑鱼头肾、脾脏和肝脏中SPHK1 m RNA表达水平随着时间的延长而呈现不同的变化趋势,其中在肝脏中其表达量呈现明显的先升高再下降的趋势,并在攻毒后24 h达到最高。同时,扩增到的SPHK1基因5’端上游1931 bp的非编码序列,其中含有6个潜在的核心区域。通过构建候选启动子区不同截短片段的重组质粒测定活性,确定了SPHK1基因核心启动子区为-1931~-1587和-419~+92,并在其中分别预测到48和22个可能的转录因子结合位点。以上结果为研究黄姑鱼SPHK1基因的功能和作用机制以及转录调控奠定了基础,同时也为解析与调控抗病作用相关的分子机制提供理论基础。
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