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目的:以弓形虫PRU-T2株感染巨噬细胞建立体外感染模型,免疫荧光技术检测含虫空泡膜上介导其与溶酶体融合的三种蛋白(Rab5、Rab7、EEA-1)的动态变化。研究弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合的机制,为阐明弓形虫免疫逃逸的机制及合理设计其疫苗提供实验依据。方法:1建立体外弓形虫感染细胞模型分别培养小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡巨噬细胞、RAW264.7鼠传代巨噬细胞,用PRU-T2弓形虫感染细胞(以灭活的PRU-T2弓形虫为阴性对照),分别于30 min、60 min、90 min及120 min取出盖玻片,固定,瑞氏染色。比较弓形虫入侵以上4种细胞形成含虫空泡的时间与数量。选择合适的细胞用于下一步研究。2间接免疫荧光技术分别检测Rab5、Rab7、EEA-1在含虫空泡膜上的动态分布取对数生长期细胞消化吹散;将细胞铺于预置有盖玻片的24孔板中,待细胞爬片后将弓形虫加入到孔中感染巨噬细胞;取出盖玻片,用4%多聚甲醛固定10-30min;用0.5% Triton-100处理10-20min;加入2%胎牛白蛋白,37℃温箱中孵育1h封闭;加入适当稀释比的一抗工作液,4℃过夜;洗涤,加二抗,37℃温箱中孵育1h;洗涤,晾干,摄像。结果:1比较了PRU-T2弓形虫感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡腔巨噬细胞、RAW264.7细胞后对细胞状态的影响及含虫空泡形成的时间与数量。从接种鼠腹腔取出4℃放置1-2天的虫体,分别感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡腔巨噬细胞、RAW264.7细胞,于30min计数50个细胞中含虫泡的数量分别是50、10-50、50-80、50-100。2 Rab5在含虫空泡膜上持续存在,在热灭活弓形虫吞噬体上随着时间的推移,含量下降直至消失;在含虫空泡膜上检测不到Rab7,在热灭活弓形虫吞噬体膜上Rab7含量升高; EEA1(早内体自身抗原1)在含虫空泡膜上无,在热灭活弓形虫吞噬体膜上存在。结论:1弓形虫侵入RAW264.7细胞形成含虫空泡的时间相对早、数量相对多。且RAW264.7细胞容易培养,所以适合下一步研究。2 Rab5、Rab7、EEA-1三种蛋白在含虫空泡膜上的动态变化提示弓形虫可能通过保留Rab5、排除Rab7而维持含虫空泡的早内体性质,并通过阻止EEA-1在含虫空泡上的出现抑制含虫空泡与溶酶体的融合,从而达到免疫逃逸的目的。