【摘 要】
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近年来由于抗生素的大量使用,导致临床耐药株日益增多,故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。抗菌肽热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速等特点,不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫,部分还有一定抗恶性肿瘤作用,并且不易产生耐药性,对真核细胞毒性作用低等特点。随着分子生物学和生物技术的飞速发展,转基因植物的研究取得了一系列突破性成就,愈来愈受到世人瞩目。用植物生物反应器生产重组疫苗、重组抗体和其
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近年来由于抗生素的大量使用,导致临床耐药株日益增多,故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。抗菌肽热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速等特点,不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫,部分还有一定抗恶性肿瘤作用,并且不易产生耐药性,对真核细胞毒性作用低等特点。随着分子生物学和生物技术的飞速发展,转基因植物的研究取得了一系列突破性成就,愈来愈受到世人瞩目。用植物生物反应器生产重组疫苗、重组抗体和其他药用蛋白已成为国内外基因工程研究热点之一。植物作为反应器可以排除产品被内毒素或以人病原体污染的危险,在表达蛋白时可以不加工或部分加工后被采用。因此,植物生物反应器为重组蛋白的生产提供了广阔的前景。天蚕素AD（CecropinAD,CAD）是人工合成的由cecropin A的N端1～11肽段和cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽,具有较高的抗菌活性和抗肿瘤活性。基于抗菌肽的天然含量低及其在医药中的重要作用,本研究通过基因工程的手段,在紫花苜蓿中表达按照植物偏好性密码子合成的天蚕素AD,探索利用紫花苜蓿作为反应器生产抗菌肽的可行性研究,为抗菌肽转基因苜蓿的产业化推广奠定基础。表达载体中插入了对外源基因表达有一定促进作用的调控元件：Q序列、Kozak序列及KDEL四肽序列；将其克隆进pCAMBIA1390中,构建了pCAMBIA1390CAD植物表达载体。将重组质粒转入农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导方法将CAD转化入紫花苜蓿。在含潮霉素（20mg/L）的筛选培养基上筛选转基因植株,通过PCR、Southern blotting和抑菌活性检测,得到以下结论：1.成功合成植物偏好密码子CAD基因。2.将测序正确CAD基因插入到pCAMBIA1390中,得到含CAD基因的植物表达载体pCAMBIA1390CAD。3.PCR和Southern杂交结果显示目的基因已经已成功整合到苜蓿基因组中。4. RT-PCR结果表明目的基因在苜蓿各个株系中都有转录。5.抑菌活性检测,结果表明CAD基因已经转入紫花苜蓿中,并成功得到表达。
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