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背景牙龈软组织的修复再生对口腔修复美学的构建以及牙周病的恢复都起到重要作用。目前,结缔组织移植(connective tissue graft,CTG)是治疗牙龈软组织量不足的金标准,然而在多发性牙龈退缩或缺损的情况下,可供移植的结缔组织数量有限,提取组织的相关手术部位术后并发症发生几率增加,而现专用于牙龈软组织移植的替代产品较少。因此,研发具备良好的生物活性以及易于获取的牙龈替代材料,特别是能够模拟天然牙龈组织结构的组织工程化牙龈具有重要意义。组织工程的三大要素是种子细胞、支架和生长因子。种子细胞作为组织工程的基础,细胞行为受多种生物材料诱导信号的影响,如支架的结构、释放的化学分子和力学等。因此,探讨支架的拓扑信号和化学信号对人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblasts,HGFs)行为的影响可为牙龈再生替代支架的研发提供重要参考。本研究通过静电纺丝技术制备有序和无序纤维支架,以这两种纤维结构作为拓扑信号,以聚多巴胺(Polydopamine,PDA)及碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)作为两种化学信号,研究HGFs在单种或多种信号共同作用下的细胞行为。研究目的本研究的目的是探讨HGFs在单种或多种信号联合作用下细胞的增殖情况,相关目的基因和蛋白的表达情况。材料和方法本课题分为两个部分:1、静电纺丝纤维支架的制备及性能表征(1)通过静电纺丝技术制备无序及有序的纯聚己内酯(Poly(e-caprolactone),PCL)支架,再通过PDA表面涂布法对纯PCL支架进行表面改性,制备PCL/PDA-R和PCL/PDA-A纤维支架(R:Random;A:Aligned)。(2)使用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)、X射线光电子能谱分析仪(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)和万能力学测试机对纤维支架进行表征、化学元素组成和力学性能的分析比较。2、拓扑信号和化学信号对细胞行为的调控(1)以静电纺丝纤维支架的无序和有序结构作为拓扑信号,以涂布在纤维支架上的PDA和添加于培养基中碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)为化学信号。设置PCL-R+C、PCL-R+F、PCL-A+C、PCL-A+F、PCL/PDA-R+C、PCL/PDA-R+F、PCL/PDA-A+C、PCL/PDA-A+F(C:Common culture medium;F:bFGF culture medium)八个小组。(2)通过SEM,激光共聚焦显微镜观察HGFs受单种信号或多种信号共同作用5天后的细胞生长状态,形态和骨架。(3)在单种信号或多种信号的共同作用下,通过CCK-8实验研究HGFs在第1、3、5、7天的细胞增殖情况。(4)通过RT-PCR分析探究第5天支架上HGFs的一型胶原(Collagen I,COL I)、黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)的基因表达水平。(5)通过免疫荧光染色观察第5天支架上HGFs的COL I、FAK、FN的分泌情况以及分布,并对图像进行免疫荧光半定量分析,探究目的蛋白的表达水平。结果(1)SEM观察发现,PCL-A支架的纤维排列高度有序,PCL-R支架的纤维则随机无序排列。经PDA涂布的PCL支架纤维上可见点状沉积。无序组(Random group,R组)与有序组(Aligned group,A组)以及PCL组和PCL/PDA组之间纤维直径无显著差异(P>0.05),无序组和有序组之间取向角度具有显著差异(P<0.05)。(2)力学检测结果显示,随着纤维有序性的提高而杨氏模量以及拉伸强度显著增大,断裂伸长率显著减小(P<0.05)。在涂布PDA后,纤维支架的杨氏模量、拉伸强度和断裂伸长率有所提高。(3)CCK-8结果示,各组的OD值(optical density,光密度)随着时间增大但速度不同。在普通培养基培养条件下,有序组培养后期的细胞增殖率高于无序组。在拓扑信号和培养基条件一致的情况下,PCL/PDA组在3、5、7天的OD值显著大于PCL组(P<0.05)。普通培养基组(Common medium group,C组)与bFGF培养基组(bFGF medium group,F组)比较发现第三天后才具有显著差异(P<0.05)。(4)SEM和细胞骨架染色图片显示,PCL/PDA组相比PCL组,F组比C组的细胞密度要大。有序组支架上HGFs沿着纤维高度有序生长,而无序组上的细胞随机混乱排列。活死细胞染色结果显示,支架上只存在极少量死细胞,细胞生长密度与SEM及细胞骨架染色结果基本对应。(5)RT-PCR结果显示,与无序组相比,有序组的COL I、FAK和FN的基因表达水平较高。PCL/PDA组比PCL组比较显著提高(P<0.05)。除了COL I,F组的FAK和FN基因表达水平趋势比C组高。(6)免疫荧光染色以及半定量分析结果显示,三种目标蛋白在有序组支架上呈有序分布,在无序组支架上呈随机分布。伴随着化学信号的添加,PCL/PDA组蛋白分泌水平明显比PCL组高(P<0.05)。除了COL I,F组的FAK和FN均比C组的分泌量高。结论有序纤维支架相对于无序纤维支架更有利于HGFs的增殖分化,PDA和bFGF可进一步促进细胞的增殖分化,其中PDA的诱导促进效果最佳。相比拓扑信号或化学信号单独作用,两者的联合应用对于HGFs行为的调控具有协同促进效果。