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目的:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。近年来,其发病率及死亡率在我国及全世界呈上升趋势。尽管放疗、化疗、分子靶向治疗及多种生物治疗手段有了长足发展,但乳腺癌复发、转移等仍然是导致乳腺癌患者死亡的重要原因。因此,探索乳腺癌浸润、转移的分子生物学机制成为现今的研究热点。越来越多证据表明,TET1(ten-eleven translocation1)是催化DNA去甲基化过程的重要蛋白,可通过促使5-甲基胞嘧啶(5m C)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),参与DNA去甲基化和相关基因表达的调控过程。在人类实体肿瘤中,TET1基因突变与肿瘤发生发展有着显著相关性,积极探索其与乳腺癌侵袭转移的机制,将为治疗乳腺癌提供重要的实验依据。为此,本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞株为模型,通过建立过表达TET1的MDA-MB-231细胞株,研究TET1对MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭等生物学行为的影响,并初步探究其相关分子机制,旨在为临床预防和治疗肿瘤寻找新的靶点。方法:1应用慢病毒载体,建立TET1过表达稳转细胞株(MDA-MB-231-TET1)及携带e GFP的阴性对照组稳转细胞株(MDA-MB-231-negative control,MDA-MB-231-NC),SYBR Green法实时荧光定量PCR检测TET1在转录水平的表达情况,Western blot法检测TET1在蛋白水平的表达情况。2倒置显微镜下观察转染后的细胞形态,以MDA-MB-231-NC作为阴性对照组,以MDA-MB-231作为空白对照组,应用CCK-8法检测过表达TET1对MDA-MB-231细胞增殖的影响,应用流式细胞学技术检测TET1对细胞周期的影响,应用细胞划痕实验及TranswellTM小室检测TET1对细胞迁移、侵袭能力的影响,并应用免疫荧光及Western blot检测TET1与EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin)分子的表达。3将MDA-MB-231-TET1、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231三组细胞分别接种于裸鼠腋下,建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长情况,比较三组细胞成瘤时间、瘤体体积及质量,并绘制生长曲线。4应用SPSS13.0统计软件进行数据分析,两独立样本的比较应用成组t检验分析,多组间均数比较应用单因素方差分析,数据用mean±SD表示,每组实验不少于3个独立样本的重复,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1成功建立过表达TET1的MDA-MB-231细胞模型,SYBR Green法实时定量PCR检测TET1表达,结果显示,在过表达模型中,与阴性对照组(MDA-MB-231-NC)相比,MDA-MB-231-TET1细胞中TET1上调3.11±4.61倍,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测TET1表达,应用Image J扫描灰度值,结果显示,与阴性对照组(MDA-MB-231-NC)相比,MDA-MB-231-TET1细胞中TET1上调2.67±1.55倍,差异有统计学意义(P<0.05)。2 CCK-8法检测细胞增殖能力,空白对照组(MDA-MB-231)及阴性对照组(MDA-MB-231-NC)之间,细胞增殖未见明显差异(P>0.05),而MDA-MB-231-TET1细胞增殖能力较前两组明显减低,差异有统计学意义(P<0.001)。3流式细胞学技术检测细胞周期结果显示,与阴性对照组(MDA-MB-231-NC)相比,MDA-MB-231-TET1细胞G2/M期比例增加(MDA-MB-231-TET1 13.24±3.64%vs MDA-MB-231-NC 4.30±1.36%),过表达TET1诱导细胞周期G2/M期阻滞,差异有统计学意义(P<0.01)。4细胞划痕实验细胞检测肿瘤细胞迁移能力,与空白对照组(MDA-MB-231)及阴性对照组(MDA-MB-231-NC)相比,MDA-MB-231-TET1细胞迁移能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。5 TranswellTM小室检测肿瘤细胞侵袭能力,与空白对照(MDA-MB-231)及阴性对照组(MDA-MB-231-NC)相比,MDA-MB-231-TET1细胞侵袭能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。6倒置显微镜下观察细胞形态,过表达TET1的MDA-MB-231-TET1细胞形态并未发生明显变化,进一步检测EMT相关分子标志物发现:Western blot法:与阴性对照组及空白对照组细胞相比,MDA-MB-231-TET1组细胞E-cadherin表达升高(P<0.001),N-cadherin、Vimentin表达降低(P<0.05),β-catenin表达降低(P<0.001),差异均有统计学意义。免疫荧光法:与阴性对照组及空白对照组细胞相比,MDA-MB-231-TET1组细胞E-cadherin表达明显升高,N-cadherin、Vimentin表达降低,MDA-MB-231-TET1组、阴性对照组及空白对照组细胞的细胞浆和细胞核均有β-catenin表达,但相较于MDA-MB-231-TET1组细胞,阴性对照组及空白对照组细胞的细胞核内β-catenin表达升高,提示其向核内转移。7、动物实验观察荷瘤裸鼠大小,结果显示,接种MDA-MB-231-TET1组细胞的裸鼠肿瘤大小与对照组无明显差异(P>0.05)。结论:1成功构建稳定过表达TET1的MDA-MB-231-TET1细胞模型及相应阴性对照细胞株MDA-MB-231-NC。2 TET1通过阻滞细胞周期G2/M期,抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。3 TET1抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭能力,其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。