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抗生素的过量使用和滥用导致大量耐药菌的出现,特别是超级耐药菌的出现,对人类健康造成严重的威胁。寻找新的更为安全高效的抗生素,以及不易产生细菌耐药性的抗生素替代物,对于保障人类健康,以及健康食品生产和动物养殖具有重要意义和迫切需求。抗菌肽类物质是天然抗菌物质,具有稳定性好、无毒副作用、不会出现细菌耐药性等突出优点,也具有替代某些抗生素的潜力。因此,本项研究的目的是利用基因工程的方法,构建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重组表达质粒,将重组质粒导入毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中进行异源表达,获得了酵母表达的抗菌肽和抗菌酶,旨在为抗菌肽类物质的实际应用提供技术资料。本论文报道了几种抗菌肽类物质和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母异源表达的主要研究结果。1、构建了对革兰氏阴性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重组表达载体pPICAP,将其导入毕赤酵母SMD1168中,获得了抗E.coli的毕赤酵母菌株AP26,该菌株在培养的72 h时抑菌活性最高,之后抑菌活性降低,表明72 h时抗菌肽AP的表达量最高。进一步研究表明,在培养的72 h后,重组菌抑菌活性降低是因为发生了质粒的丢失。LC-MS结果表明重组菌株正确表达了抗菌肽AP。对菌株AP26进行了亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到了抗菌肽AP表达量最高的诱变菌株APmu4,其抗菌肽AP最高生物效价达到1.7×109 U/L。对影响抗菌肽AP表达量的因素进行了研究,发现pH为7.5、接种量为50g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AP的表达量。2、构建了具有广谱抗菌活性的抗菌肽AB基因的重组载体pPICAB,将其导入到毕赤酵母SMD1168菌株中,获得分泌表达抗菌肽AB的毕赤酵母菌株,该重组菌株对E.coli有抗性,LC-MS结果表明该菌株正确表达了抗菌肽AB。对重组菌株进行了NTG诱变,筛选到超量表达抗菌肽AB的诱变菌株ABN97。为了进一步提高诱变菌株抗菌肽AB表达量,构建了颤藻血红蛋白基因vgb的重组载体,将其导入到菌株ABN97中,筛选出了抑菌效果最好的菌株ABN97vgb,抗菌肽AB生物效价达到4.53×108 U/L。对影响抗菌肽AB表达量的因素进行了研究,发现pH为6.0、接种量为50 g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AB的表达量,最高表达量提高了14倍。3、构建了对革兰氏阳性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌丝霉素Plectasin基因重组质粒pPICPle,将其导入毕赤酵母并成功异源表达抗菌肽Plectasin。对重组菌株进行NTG诱变并筛选得到高效表达Plectasin的诱变菌株Ple100,其Plectasin的表达量提高了1.93倍。对影响菌株Ple100 Plectasin表达量的因素进行研究,结果表明盐浓度较高的YDFMY培养基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表达量。4、构建了抗菌肽PSI基因的整合型载体pLACPSI和游离型载体pKDUPSI,将其导入到乳酸克鲁维酵母KlSEL1基因突变型菌株中,筛选到分泌表达抗菌肽PSI的重组菌株。对重组菌株发酵液中抗菌肽PSI进行硫酸铵沉淀法和阳离子交换柱纯化,SDS-PAGE检测验证了抗菌肽PSI。对重组菌株产抗菌肽PSI的发酵条件进行优化,结果表明中性或偏碱性、酵母提取物和盐度较高的YDFMY培养基更有利于抗菌肽PSI的表达。纯化的抗菌肽PSI对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、三线镰刀菌(Fusarfum tricinctum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、平头炭疽(Colletotrichum truncatum)有抗性。水果保鲜实验表明纯化后的抗菌肽PSI也具有开发为新型果蔬保鲜剂的潜力。5、构建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型载体pLACGOX和游离型载体pKDUGOX,成功将其导入到乳酸克鲁维酵母KlSEL1基因突变型菌株中,获得了一株能超量分泌表达GOX的乳酸克鲁维酵母菌株,其GOX最大表达量为70?7 kU/L,SDS-PAGE检测验证了GOX正确表达。研究了影响GOX酶活的因素,结果表明pH4件下GOX酶活最高,温度为37℃时GOX稳定,YPGal培养基中的高盐浓度对GOX有抑制作用。